PMC

1SZCZEGÓŁOWE protokoły i wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów dotyczących wszystkich aspektów systemu ekspresji białka fuzyjnego genu GST są dostępne w podręcznikach firmy GE Healthcare: GST Gene Fusion System, numer produktu 18-1157-58 oraz Podręcznik rekombinowanego białka, numer produktu 18-1142-75. Podręczniki są dostępne do kupienia w wersji papierowej lub w formacie PDF na stronie internetowej GE Healthcare.

2zaleca się stosowanie JM105 lub podobnego szczepu do klonowania i konserwacji wektora. Szczepy BL21 i jego pochodne lub inny szczep z niedoborem proteazy są zalecane dla maksymalnej ekspresji białka. Szczepy z niedoborem produktów genowych proteazy cytoplazmatycznej, takich jak lon, ompT, degP lub htpR, mogą zminimalizować skutki proteolitycznej degradacji nadekspresowanego białka przez gospodarza. Nie należy stosować szczepu E. coli, który przenosi allel rec1A do propagacji plazmidów pGEX, ponieważ donoszono o delecjach lub rearanżacjach plazmidowego DNA.

3glutation Sepharose 4B masowe media są używane w tym protokole oczyszczania. Ten nośnik chromatograficzny jest idealny do warunków przesiewowych i pozwala na łatwe skalowanie. Oczyszczanie przeprowadza się łatwo przy użyciu przepływu grawitacyjnego lub systemu chromatografii niskociśnieniowej, lub może być stosowane w oczyszczaniu wsadowym opartym na wirowaniu. Kolumny gstrap FF affinity to 1 ml lub 5 ml zapakowane kolumny, które również są dostępne i mogą być połączone szeregowo w celu zwiększenia skali. Kolumny te są przeznaczone do stosowania z systemem chromatografii cieczowej, pompą lub strzykawką. Oprócz tych formatów, Sefarose glutationu jest również dostępny w kolumnach spin i 96-studzienkowych formatach płyt do szybkiego przesiewania ekspresji białka fuzyjnego GST i warunków oczyszczania.

4DFP jest niezwykle niebezpieczną neurotoksyną. Należy przestrzegać środków ostrożności dostarczonych przez producenta i obsługiwać tylko czysty odczynnik w dygestorium chemicznym.

5dodanie inhibitorów proteazy do buforu lizy pomoże zapobiec proteolitycznej degradacji białka docelowego podczas ekstrakcji. Jednakże dokładna mieszanka inhibitorów proteazy dodanych do buforu lizy powinna być dostosowana do właściwości białka docelowego. W razie potrzeby do bufora należy dodać środki redukujące, takie jak 2-ME, DTT lub TCEP w stężeniach 1-10 mM. Do buforu można również dodać niejonowy detergent, taki jak 1% Triton X-100, aby wspomóc ekstrakcję.

6Following jest protokołem przesiewowym w celu sprawdzenia poziomu ekspresji białka fuzyjnego w mini-kulturach. Obecność wzrostu poziomu białka przy oczekiwanej masie cząsteczkowej w żelu SDS-PAGE po indukcji IPTG jest dobrym wskaźnikiem udanej ekspresji białka. Po indukcji widoczne powinno być wyraźne pasmo przy oczekiwanej masie cząsteczkowej (Masa cząsteczkowa białka docelowego + ~ 26 KDa dla ugrupowania GST). Jeśli podejrzewa się, że białko ulega ekspresji na niskim poziomie, weryfikację prawidłowej ekspresji można przeprowadzić stosując Western blotting z przeciwciałem specyficznym dla białka docelowego lub GST. Jeżeli próbki nie zostaną natychmiast przeanalizowane przez SDS-PAGE, można je przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub -20 °C w celu przechowywania przez dłuższy czas.

1. zaszczepić kilka izolowanych Kolonii do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml zawierających 10 ml LB uzupełnionych 100 µg/ml ampicyliny. Wyhoduj nocną kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.

2. następnego ranka dodaj 0,5 ml kultury na noc do 4,5 ml LB z 100 µg/ml ampicyliny. Dorastać 1 h w temperaturze 37 °C.

3. wyjąć 1 ml nieindukowanej próbki. Odwirować i usunąć supernatant. Zamrażać lub przechowywać w lodzie, aż będzie gotowy do uruchomienia SDS-PAGE.

4. Dodaj IPTG do końcowego stężenia 1 mM i rozwijaj przez dodatkowe 2-3 godziny.

5. pobrać 1 ml próbki indukowanej. Odwirować i usunąć supernatant. Zamrażać lub przechowywać w lodzie, aż będzie gotowy do uruchomienia SDS-PAGE.

6. wymieszać granulki komórek w 200 µl buforu próbki SDS-PAGE; ogrzać 3-5 min w temperaturze 90 °C.

7. przeanalizuj 5-10 µl za pomocą SDS-PAGE, a następnie coomassie Blue barwienia (lub 1-2 µl dla Western blot).

7 próbek hodowanych w minikulurach można również wykorzystać do oceny rozpuszczalności danego białka fuzyjnego (patrz uwaga 6 dotycząca protokołu ekspresji w minikulurach). Pod koniec okresu indukcji zbieraj komórki przez odwirowanie. Osad wymieszać w 200 µl zimnego PBS. Lizyj komórki za pomocą sonikacji; trzymaj próbkę na lodzie. Zapisz małą porcję lizatu do analizy przez SDS-PAGE. Odwirować lizowaną próbkę przez 15 minut. Usunąć supernatant do osobnej probówki. Osad wymieszać w 200 µl PBS. Przeanalizuj niektóre z surowego lizatu, supernatantu i wymieszanego osadu za pomocą SDS-PAGE lub Western blotting. Jeżeli próbkę obserwuje się zarówno we frakcji lizatu, jak i supernatantu, próbka jest odpowiednio rozpuszczalna. Jeżeli próbka jest obecna głównie w lizacie i wymieszanym granulacie, próbka jest najprawdopodobniej w ciałach okluzyjnych. W przypadkach, gdy białko znajduje się w ciałach inkluzji, zbadaj różne warunki ekspresji, aby przenieść ekspresję do postaci rozpuszczalnej (patrz uwaga 8).

8jeśli białko fuzyjne ulega ekspresji głównie w ciałach inkluzji (np. >80% nierozpuszczalny), różne strategie mogą być stosowane w celu poprawy rozpuszczalności. Często indukcja w niższej temperaturze (15-25 °C) jest skuteczna w przesuwaniu ekspresji z ciał inkluzji do frakcji rozpuszczalnej. Komórki indukowane w tej niższej temperaturze będą rosły wolniej i będą wymagały nocnych okresów indukcji. W niektórych przypadkach może być konieczne zastosowanie alternatywnych szczepów gospodarza lub modyfikacje konstrukcji plazmidowej. Jeśli białko fuzyjne pozostaje głównie w ciałach inkluzji, nawet po próbach uzyskania rozpuszczalnego białka, warto zwiększyć produkcję E. coli i oczyścić wystarczającą ilość białka z niewielkiej ilości rozpuszczalnego białka, które jest dostępne. W niektórych przypadkach należy zbadać inne tagi białka fuzyjnego.

9 niski poziom ekspresji białka może być wynikiem rzadkiego użycia kodonu. W tym przypadku przejście na inny szczep E. coli, który zawiera dodatkowe transkrypty rzadkiego kodonu tRNA, może znacznie poprawić produkcję białka. Różne preparaty mediów lub dodanie do 2% glukozy również może poprawić ekspresję (13, 14). Jeśli podejrzewa się, że wyrażone białko jest toksyczne dla komórek (zwykle przestaną rosnąć po indukcji z IPTG), spróbuj indukować w późniejszym punkcie czasowym przez krótszy czas. Zmniejszenie stężenia IPTG jest kolejną opcją, którą należy zbadać.

10monitor wzrostu komórek poprzez odczyt gęstości optycznej przy 600 nm (A600). Nocna kultura powinna osiągnąć A600 ~1-1, 2. Komórki powinny być indukowane we wczesnej fazie logarytmicznej krzywej wzrostu E. coli, A600 ~ 0,5 do 0,7. W temperaturze 37 °C hodowle potrzebują około 2 godzin, aby osiągnąć wczesny logarytmiczny etap wzrostu. Jeśli komórki są uprawiane w niższej temperaturze, czas inkubacji musi zostać wydłużony, ponieważ komórki będą rosły wolniej w niższych temperaturach. Ogólnie rzecz biorąc, największą wydajność białka fuzyjnego uzyskuje się, gdy komórki są indukowane przy A600 = ~ 0,5. Po indukcji IPTG ogólne wytyczne dotyczące czasu inkubacji są następujące: 3 h w temperaturze 37 °C, 5 h w temperaturze 30 °C i przez noc w temperaturze 25 °C lub niższej. Zbierz komórki przed nasyceniem, A600 ~ 1,0-1,2.

11 aby zapewnić odpowiednie napowietrzanie, kolby powinny być napełniane tylko do 20-30% ich pojemności.

12 Ważne jest, aby w próbce przed rozpadem trombiny lub czynnika Xa nie były obecne żadne inhibitory proteazy serynowej. Przed rozszczepianiem trombiny lub czynnika Xa należy usunąć następujące inhibitory proteazy: aebsf, APMSF, antytrombina III, antypaina, α1-antytrypsyna, aprotynina, chymostatyna, hirudyna, leupeptyna i PMSF. Ponadto benzamidyna PEFABLOC TH jest swoista dla trombiny, a Pefabloc FXa jest swoista dla czynnika Xa. Należy unikać stosowania następujących inhibitorów proteazy: 100 mm ZnCl2, 100 µM chymostatyny i 4 mM Pefabloc.

13 istnieje wiele alternatywnych metod wykrywania białek fuzyjnych GST. W przypadku białek, które dobrze wyrażają się na wysokim poziomie, najprostszą metodą monitorowania oczyszczania są żele SDS-PAGE barwione niebieską lub srebrną plamą Coomassie. Alternatywą dla białek, które wyrażają się przy niskich poziomach, jest użycie Western blotting przy użyciu przeciwciała skierowanego na GST lub białko docelowe. Alternatywą dla wyrażeń na małą skalę jest monitorowanie obecności GST za pomocą testu ELISA lub testu enzymatycznego CDNB.

14zapisać niewielką ilość próbki białka z każdego etapu oczyszczania, w tym lizy, supernatantu, granulatu, niezwiązanych frakcji z załadunku próbki, etapów przemywania i etapów elucji, które mają być analizowane za pomocą SDS-PAGE lub Western blotting. Po przeanalizowaniu i zsumowaniu wszystkich próbek należy wyrzucić niechciane frakcje.

białka 15gst można również oczyszczać za pomocą metody oczyszczania wsadowego. Metoda oczyszczania wsadowego jest szybka, łatwa i wymaga niewielkiego sprzętu; jednakże powstałe białko może zawierać więcej zanieczyszczeń i mieć niższą wydajność niż oczyszczanie oparte na chromatografii. Oczyszczanie wsadowe najlepiej wykorzystać podczas przesiewania warunków oczyszczania. Oczyszczanie wsadowe opisane poniżej odbywa się zazwyczaj w temperaturze pokojowej. Aby zminimalizować ryzyko degradacji proteolitycznej, procedurę można przeprowadzić w temperaturze 4 °C, zwiększając czas inkubacji 2 – do 4-krotnie.

1. komórki Lizy i uzyskują rozpuszczalne białko fuzyjne (patrz UWAGI 8 i 21, jeśli próbka znajduje się w ciałach inkluzji).

2. dodać 2 ml 50% zawiesiny glutationu Sepharose bulk matrix (1 ml objętości złoża) na 100 ml supernatantu lizatu bakteryjnego. Inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

3. Wirówka 500 × g przez 5 min. Usuń supernatant i zapisz do analizy przez SDS-PAGE w celu określenia wydajności wiązania.

4. zmyć żywicę 10 objętościami złoża PBS. Delikatnie wymieszać, a następnie odwirować 500 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant. Powtórz kroki mycia i wirowania w sumie 3 prania po 10 objętości łoża.

5. Elucję białka fuzyjnego poprzez zmieszanie żywicy z 1,0 ml buforu elucyjnego glutationu na ml objętości złoża. Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej. Wirówka 500 × g przez 5 min. Przenieść supernatant zawierający białko fuzyjne do oddzielnej probówki. Powtórz kroki elucji i zbierania łącznie 3 razy. Supernatanty mogą być połączone lub analizowane oddzielnie przez SDS-PAGE w celu monitorowania zawartości białka (patrz uwaga 12).

16A objętość złoża jest równa połowie 50% zawiesiny glutationu Sepharose 4B stosowanej do oczyszczania. Aby przygotować 50% zawiesinę sefarozy glutationowej( dostarczana jest jako ~ 75% zawiesiny): określić objętość złoża wymaganą dla skali oczyszczania. Wymieszać glutationową Sepharose 4B. na każdy ml wymaganej objętości złoża pipetą 1,33 ml zawiesiny 75% do rurki wirówki o odpowiedniej wielkości. Wirować w temperaturze 500 × g przez 5 minut. Dekantować super. Przemyć 10 objętościami złoża (10 ml na 1,33 ml pierwotnej zawiesiny) PBS, delikatnie odwracając probówkę kilka razy w celu wymieszania, a następnie odwirować 500 × g przez 5 minut. Dekantować super. Brak usunięcia roztworu do przechowywania etanolu może zakłócać kolejne etapy wiązania. Dodać 1 ml PBS na każde 1,33 ml pierwotnej zawiesiny. W ten sposób powstaje 50% zawiesina.

17glutation Sepharose ma minimalną zdolność wiązania 8 mg / ml. Kolumna o pojemności 20 ml powinna być odpowiednia do oczyszczania białka z 3 × 600 ml kultur E. coli, które zawierają ~ 20-40 mg białka fuzyjnego na hodowlę. Zarówno ilość użytej żywicy, jak i rozmiar kolumny można skalować w górę lub w dół w zależności od ilości białka do oczyszczenia.

18wymieszać osad używając 25-50 µl buforu do płukania na ml oryginalnej kultury.

19rozłamanie komór jest zakończone, gdy zawiesina częściowo oczyszcza się i zmienia nieco ciemniejszy kolor. Unikaj piany podczas sonikacji, ponieważ może to prowadzić do denaturacji białka fuzyjnego. Unikaj oversonizacji, ponieważ może to prowadzić do wspólnego oczyszczania białek gospodarza E. coli wraz z białkiem fuzyjnym GST. Wysoka lepkość z powodu uwalniania kwasów nukleinowych podczas sonikacji można zmniejszyć przez dodanie DNazy lub benzoazy do buforu lizy. Lizozymu do stężenia 0.2 mg / ml można dodać jako pomoc w lizie komórek. Alternatywą dla sonikacji jest zastosowanie dostępnych na rynku preparatów do ekstrakcji komórek. Produkty te mogą jednak zawierać zastrzeżone komponenty, które zakłócają dalsze zastosowania.

20jeśli próby przesunięcia ekspresji z ciał inkluzji do frakcji rozpuszczalnej nie powiodą się, nierozpuszczalne białka fuzyjne GST mogą być czasami oczyszczane w obecności denaturantów, takich jak mocznik, a następnie ponownie formowane. Z powodzeniem stosowano również solubilizację z użyciem detergentów, takich jak sarkozyl (N-laurylosarozyna) (15, 16). Chociaż poniższy protokół został z powodzeniem użyty do denaturacji i ponownego naturowania białek fuzyjnych GST, każda konstrukcja białka fuzyjnego jest unikalna i dokładne warunki denaturacji i ponownego naturowania muszą być określone empirycznie. Typowe denaturanty, które z powodzeniem zastosowano, to guanidyna HCl, mocznik, Tween 20, CTAB i SDS (17, 18). Następnie denaturanty muszą zostać całkowicie usunięte, aby umożliwić prawidłowe ponowne formowanie białka. Warunki, które powinny być zoptymalizowane w celu ułatwienia ponownego składania obejmują: rodzaj denaturantu, pH, obecność środka redukującego, szybkość usuwania denaturantu i stężenie białka. Po odtworzeniu białka sprawdź, czy białko odzyskało swoją natywną konformację i funkcję oraz Usuń niewłaściwie złożone białko.

1. wstępnie zrównoważyć kolumnę sefarozy glutationowej; sonifikować granulowane komórki E. coli i oddzielić supernatant lizatu i frakcje granulatu przez odwirowanie (patrz 3.3 Oczyszczanie powinowactwa białka fuzyjnego GST etapy 1-8). Zawiesinę lizatu, która zawiera korpusy inkluzji, wymieszać w 15 ml buforu do płukania. Odwirować 20 min w temperaturze 48 000 × g (4 °C). Zdekantować supernatant i wymieszać umyte granulki w 12 ml buforu U (wymieszać w 20 µl buforu u na ml pierwotnej Kultury). Inkubować 2 h na lodzie.

2. odwirować 20 min w temperaturze 48 000 × g (4 °C). Przenieść supernatant zawierający denaturowane białko fuzyjne do czystej probówki wirówki.

3. dodać Triton X-100 do supernatantu do końcowego stężenia 1%.

4. Dializuj próbkę do PBS / glicerolu przez 2-3 godziny. objętość buforu do dializy powinna wynosić co najmniej 20-krotność objętości próbki.

5. Dializuj próbkę przez noc w porównaniu z PBS inhibitorami proteazy, stosując objętość bufora > 100 razy większą od objętości próbki.

6. usunąć próbkę z dializy i odwirować 20 min przy 4000 × g.

7. wyekstrahowane i odrodzone białko z ciał inkluzji można teraz zastosować do kolumn sefarozy glutationowej i oczyścić.

rozwiązania:

bufor myjący: 50 mm Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptyna, 1 µg/ml pepstatyna, 0,15 mm PMSF, pH 8,0

bufor U: 5 m mocznik, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-ME, 1 µg/ml leupeptyna, 1 µg/ml pepstatyna, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/glicerol: 1x PBS, 20% glicerol, 1% Triton X-100, 5 mm 2-me, 5 mm EDTA, 5 mm 2 – Me, 1 µg/ml leupeptyna, 1 µg/ml pepstatyna, 0,15 mM Pmsf, 1 mM DFP pH 7,4

21 zaleca się stosowanie pompy perystaltycznej, aby równomiernie kontrolować natężenie przepływu. W przypadku sprężania żywicy ciśnienie jest zbyt wysokie, a natężenie przepływu powinno zostać zmniejszone.

22 Kinetyka wiązania między glutationem a GST jest stosunkowo powolna. Dlatego ważne jest, aby stosować niskie natężenia przepływu, aby osiągnąć maksymalną zdolność wiązania, np. 0,1 ml/min dla kolumny ID o średnicy 2,5 cm. Stosowanie zbyt szybkich szybkości przepływu może zmniejszyć ilość związanego białka fuzyjnego ze względu na powolną kinetykę asocjacji. Etapy mycia i elucji mogą być wykonywane przy szybszym natężeniu przepływu, aby zaoszczędzić czas (odpowiednio 1,5 ml/min i 0,3 ml/min). W przypadku próbek o dużej objętości Wiązanie jest najwygodniej wykonywane przez noc, z regulacją natężenia przepływu, tak aby kolumna nie wyschła.

23analiza niezwiązanych frakcji wskaże, czy białko fuzyjne wiąże się, czy nie. Jeśli białko nie jest wykrywane we wczesnych frakcjach, ale pojawia się w późniejszych frakcjach, oznacza to, że pojemność kolumny została przekroczona. Zmniejszenie obciążenia białkiem lub zwiększenie rozmiaru kolumny złagodzi ten stan.

24jeśli białko fuzyjne słabo wiąże się z Sefarozą glutationu, istnieje kilka alternatyw, aby spróbować zwiększyć skuteczność wiązania. Spróbuj łagodniejszej metody lizy. Jeśli zastosowana metoda jest zbyt surowa, białko może ulec denaturacji i w związku z tym nie może wiązać się z kolumną. Ponadto, w przypadku ponownego naturowania białka z ciał włączających, należy upewnić się, że wszystkie denaturanty zostały usunięte z buforu, poprzez wyczerpującą dializę lub zastosowanie próbki do kolumny odsalania, przed zastosowaniem do kolumny glutationu. Usunąć roztwór do przechowywania etanolu z sefarozy glutationowej; zmniejszyć kolumnę za pomocą świeżego buforu glutationowego, a następnie umyć PBS bezpośrednio przed załadowaniem próbki. Zwiększyć ilość żywicy i / lub zmniejszyć natężenie przepływu używane do załadunku próbki. Spróbuj dodać 1-20 mM DTT do próbki. Jeśli problem nadal występuje, Wyczyść kolumnę zgodnie z zaleceniami producenta. Jeśli Wiązanie nadal nie zostanie przywrócone, spróbuj użyć świeżej żywicy.

25 wydajność białka fuzyjnego można również oszacować mierząc absorbancję przy 280 nm (A280). Współczynnik ekstynkcji dla samego ugrupowania GST wynosi ~ 1,5, tj. 1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml białka, chociaż współczynnik ekstynkcji dla białka fuzyjnego będzie zależał częściowo od charakterystyki absorbancji białka docelowego.

26jeśli występuje problem z elucją białka z kolumny sefarozy glutationowej, spróbuj zmniejszyć szybkość przepływu i zwiększyć objętość buforu elucyjnego, który jest używany. Pamiętaj, aby użyć świeżego zredukowanego buforu glutationowego (zrób to w dniu, w którym zostanie użyty). Zwiększyć stężenie glutationu do 40 mM i / lub podnieść pH buforu do pH 8,0–9,0. Dodać 1-20 mM DTT (lub inny środek redukujący) do bufora. Dodanie niejonowego detergentu może również poprawić rozpuszczalność i zminimalizować wszelkie agregacje, które mogą wystąpić.

27kontaminacja oczyszczonego białka fuzyjnego białkami komórek gospodarza E. coli wskazuje, że sonikacja była zbyt ciężka. Jeśli obecne są zdegradowane fragmenty białka fuzyjnego, spróbuj dodać dodatkowe inhibitory proteazy do buforu lizy. Utrzymuj wszystkie próbki, bufory i probówki do pobierania na zimno, aby zminimalizować proteolizę. Jeśli degradacja zachodzi podczas ekspresji białka, spróbuj wywołać próbkę późno (~0.8 OD600) i zmniejszyć długość okresu indukcji. Pomocne może być również przejście na alternatywny szczep gospodarza.

28 alternatywą dla trawienia w roztworze jest proteazowe rozszczepienie białka fuzyjnego podczas wiązania z matrycą sefarozy glutationu. Białko fuzyjne ekstrahuje się i ładuje do sefarozy glutationowej, a następnie przemywa PBS (patrz oczyszczanie powinowactwa białka fuzyjnego GST, etapy 1-11). Zamiast eluować białko buforem glutationowym, roztwór PBS zawierający enzym ładuje się na kolumnę i inkubuje przez kilka godzin w temperaturze pokojowej (4 °C dla proteazy ciśnieniowej). Rozszczepione białko jest następnie wypłukiwane z kolumny kilkoma objętościami kolumny PBS. Resztkowe białko fuzyjne i ugrupowanie GST można usunąć z kolumny przez przemywanie kolumny zredukowanym buforem glutationowym. Ilość enzymu i czas inkubacji muszą być empirycznie określone dla każdego białka fuzyjnego. Przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą SDS-PAGE, aby określić wydajność cięcia i czystość białka.

29W trakcie rozszczepiania proteazy w trybie wsadowym dodać określoną empirycznie ilość enzymu do białka fuzyjnego związanego z żywicą (patrz uwaga 15 a–d). Stosować 1 ml enzymu zawierającego PBS na 1 ml objętości złoża. Inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka godzin z delikatnym mieszaniem. Odwirować 500 × g przez 5 minut, aby osadzić żywicę. Usuń super, który zawiera białko docelowe, do oddzielnej probówki. Przemyć Sefarozę glutationową PBS do 3 razy, aby odzyskać rozszczepione białko fuzyjne. Inkubować żywicę z buforem glutationowym w celu usunięcia GST i resztkowego białka fuzyjnego. Użyj 1 ml buforu glutationowego na ml żywicy. Odwirować 500 × g i odzyskać eluowany GST. Powtórz do 3 razy. Analizuj próbki według SDS-PAGE.

30jeśli stosuje się proteazę trombinową, trawienie można przeprowadzić w buforze glutationowym stosowanym do wymywania białka z kolumny. W przypadku stosowania czynnika Xa zaleca się dializę białka do buforu Tris lub buforu PBS przed trawieniem; glutation obecny w buforze elucyjnym może zaburzać mosty dwusiarczkowe obecne w czynniku Xa, prowadząc do nieefektywnego trawienia białka fuzyjnego. Empiryczne określenie warunków trawienia dla każdego białka fuzyjnego musi być określone w pilotażowym doświadczeniu trawienia. Wygodną metodą jest strawienie 100 µg białka fuzyjnego w zakresie stosunku enzymu do substratu i zmiana czasu inkubacji. Typowy czas inkubacji wynosi od 2 do 8 godzin. zalecane stosunki enzymu do substratu dla trombiny to 1:100, 1:350, 1:1000, i 1:3000 (jednostek enzymu na µg białka fuzyjnego), a dla czynnika Xa są 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg enzymu na µg białka fuzyjnego). W pożądanych punktach czasowych usunąć 2 µg białka i zatrzymać trawienie, dodając porcję próbki do gotującego się buforu próbki SDS. Analizuj próbki za pomocą SDS-PAGE, aby określić optymalne warunki cięcia. Oprócz stosunku enzymu do substratu i czasu należy rozważyć zmianę warunków buforowych, takich jak zwiększenie lub zmniejszenie stężenia NaCl lub dodanie Ca2+ do buforu (patrz uwaga 31 w celu uzyskania wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów).

31jeśli na SDS-PAGE obserwuje się wiele pasm dla białka docelowego po trawieniu, należy sprawdzić sekwencję białka docelowego pod kątem potencjalnych miejsc wtórnego rozpoznawania proteazy. Jeśli istnieją wtórne miejsca rozszczepiania, ponownie Klonuj do innego wektora. Jeśli nie obserwuje się rozszczepiania, należy sprawdzić sekwencję DNA w celu sprawdzenia obecności i integralności oczekiwanego miejsca rozszczepiania proteazy. Należy upewnić się, że inhibitory proteazy zostały całkowicie usunięte z buforu. Dodać więcej enzymu i / lub wydłużyć czas inkubacji na noc. Jeśli trawienie pozostaje niekompletne przy najwyższych proporcjach enzymu do substratu i najdłuższych punktach czasowych, należy rozważyć reinżynierię miejsca rozszczepiania proteazy w celu włączenia kilku glicyn między ugrupowaniem GST a białkiem docelowym w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia przeszkody sterycznej zakłócającej rozszczepianie (19, 20).

32jeśli hamowanie enzymu po zakończeniu trawienia przy użyciu inhibitorów proteazy serynowej jest niepożądane, próbkę można zastosować do kolumny benzamidyny HiTrap w celu usunięcia enzymu z próbki.

33jeśli próbka ma być ponownie chromatografowana na kolumnie sefarozy glutationu w celu usunięcia GST i wszelkich niestrawionych białek fuzyjnych, ważne jest, aby Zredukowany glutation został całkowicie usunięty z próbki. Glutation bardzo powoli równoważy się przez błony dializacyjne; dlatego, jeśli stosuje się dreny dializacyjne z MWCO <12 000, do całkowitego usunięcia mogą być wymagane 3 lub więcej zmian buforu. W przypadku dużych objętości próbek może być również wymagane wydłużenie czasu dializy (przez noc) i zwiększenie objętości buforu.

34 ta sama kolumna sefarozy glutationowej może być stosowana zarówno do początkowej izolacji białka fuzyjnego, jak i do regeneracji po odszczepieniu enzymatycznym. Zaleca się dedykowanie pojedynczej kolumny do indywidualnego konstruktu białkowego, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia krzyżowego różnych rekombinowanych białek. Kolumny mogą być wielokrotnie używane. Jeśli wydajność wiązania zmniejsza się z czasem, Wyczyść kolumnę zgodnie z zaleceniami producenta. Jeśli aktywność wiązania nie zostanie przywrócona, należy użyć nowej kolumny.

35maksymalne Wiązanie występuje, gdy kolumna jest całkowicie zredukowana; jeśli jednak kolumna sefarozy glutationowej została przemyta mniej niż 48 godzin przed tym etapem, etap ten można pominąć.

36błek docelowy będzie znajdował się we frakcji niezwiązanej, a GST i każde nie rozszczepione białko fuzyjne będzie wiązało się z kolumną.

37małe objętości próbek są zalecane dla dobrej rozdzielczości białka docelowego w porównaniu z innymi zanieczyszczeniami. Jeżeli nie jest możliwe zagęszczenie próbki w małej objętości, można wykonać wielokrotne wstrzyknięcie próbki.