PMC

CPV-2 jest głównym czynnikiem etiologicznym wirusowego zapalenia żołądka i jelit u psów. Należy do rodziny Parvoviridae, należącej do rodzaju protoparwowirus i gatunku Protoparwowirus typu 1. Jest to wirus bezotoczkowy z jednoniciowym genomem DNA, który koduje dwa białka kapsydowe, VP1 i VP2, wymagane do montażu i pakowania genomu wirusa, a także białka niestrukturalne NS1 i NS2, które pomagają w kontrolowaniu replikacji DNA, montażu i regulacji ekspresji genów .

w ciągu ostatnich lat CPV-2 opracował nowe warianty antygenowe. W 1980 oryginalny szczep CPV-2 został zastąpiony przez wariant oznaczony jako typ 2A (CPV-2A), w 1984 zidentyfikowano CPV-2B,A w 2001 wykryto i zgłoszono we Włoszech CPV-2C. Ostatni wariant został również zidentyfikowany w Azji, Afryce i Ameryce. Ze względu na istnienie wielu wariantów antygenowych dla CPV-2, objawy kliniczne mogą się znacznie różnić .Następnie lekarze weterynarii mają mniejszą pewność przy wystawianiu wstępnej diagnozy i zazwyczaj wymagane są niektóre badania laboratoryjne, aby potwierdzić swoją diagnozę; chociaż w laboratoriach badawczych opracowano kilka technik, takich jak testy hemaglutynacji, Immunofluorescencja, ELISA,PCR, test immunochromatograficzny i hodowla komórkowa (między innymi), w rzeczywistości techniki o największej dostępności w laboratoriach klinicznych w szpitalach weterynaryjnychtylko są testem immunochromatograficznym i PCR, jednak w badaniach dotyczących czułości i specyficzności tych procedur raporty są kontrowersyjne.Ponadto, u pacjentów o różnym stopniu nasilenia choroby, wrażliwość i specyficzność tych technik nie były szeroko badane.

celem niniejszego badania jest przedstawienie zalet i wad testu immunochromatograficznego i PCR w diagnostyce pacjentów, u których występuje duża różnorodność objawów klinicznych dla CPV-2.

badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi experimental Animal Research Mexican Official Norm Nom-062-ZOO-1999.

psy z klinicznym zapaleniem jelit hospitalizowane w szpitalu weterynaryjnym Dla Małych Zwierząt Universidad Autónoma de Estado de México, zostały przebadane pod kątem tego badania i wybrane na podstawie pozytywnego lub negatywnego testu CPV-2 przy użyciu zagnieżdżonego PCR (npcr). W rezultacie do grupy kontrolnej włączono 45 psów z wynikiem pozytywnym, a do grupy kontrolnej-5 psów z wynikiem negatywnym. 50 psów zostało przebadanych klinicznie przez trzech lekarzy weterynarii jednocześnie w celu uzyskania czułości diagnozy klinicznej. Każdy z nich wystawiał swoją domniemaną diagnozę w dyskretny sposób, wykorzystując jako narzędzie diagnostyczne problem oriented veterinary medical record (POVMR).

następnie próbki kału wszystkich psów analizowano za pomocą PCR i testu immunochromatograficznego, podczas gdy próbki krwi wykorzystano do wykonania pełnej morfologii krwi.

nPCR jest uważany za wysoce niezawodną i czułą technikę identyfikacji cząstek wirusa CPV-2 , dlatego w tym badaniu czułość użytych testów została skorelowana z tymi uzyskanymi wcześniej z nPCR dla diagnozy CPV-2.

próbki kału psa uzyskano za pomocą wymazów z odbytnicy, które zawieszono w wodzie wolnej od nukleaz i 200 µl homogeniatów, i wykorzystano do ekstrakcji DNA. Zabieg wykonano przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA ze stołka QIAamp® DNA (QIAGEN, Moguncja, Niemcy), zgodnie z zaleceniami producenta. Próbki AllDNA oznaczono ilościowo przy użyciu spektrofotometru Q5000 Quawell (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, U. S. A.). 100 ng DNA każdej próbki użytej do reakcji PCR z 50 µl końcowej objętości. Wcześniej para starterów została zaprojektowana w naszym laboratorium do amplifikacji fragmentu 275 bp, ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGTGATCCAAG-3′) i ParvoInt2CR (5′-GGTACATTTAATGCAGTTA-3′) zlokalizowanego w nukleotydach 1,107–1,130 i 1,360–1,382 genu VP2 (Liczba GenBankaccession fj0051962c).

reakcje PCR przeprowadzono stosując 2 µl każdego startera (200 nM), 12,5 µl GoTaq ® Green Master Mix (Promega, Madison, WI,U. S. A.) zawierającego polimerazę DNA, Bufor reakcyjny (pH 8,5) i 400 µM każdego nukleotydu (dATP, dgtp, Dctp i dTTP); 3 mM MgCl2.i 28.5 µl wody wolnej od nukleaz. Wszystkie reakcje przeprowadzono w następujących warunkach amplifikacji: 1 cykl w temperaturze 94°C przez 5 minut w przypadku denaturacji początkowej, następnie 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 52°C przez 1 minutę, 72°C przez 1 minutę i końcowy cykl przedłużający w temperaturze 72°C przez 5 minut.

nPCR początkowo Amplifikowano fragment 1740 bp przy użyciu starterów ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGAGCAGTTCA-3′) i ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC-3′) i zostały zaprojektowane przy użyciu sekwencji nukleotydowych 1-20 i 1,712–1,740 z genu VP2 dla psów parvovirus (GenBank accession number fj0051962c). Reakcję standaryzowano do końcowej objętości 50 µl.

mieszanina reakcyjna zawierała 1 µl polimerazy GoTaq ® Flexi DNA 5 U / µl (Promega), 5 µl GoTaq® Flexi buffer 5xgreen, 3 µl MgCl2 25 mM, 4 µl dNTP 200 µM, 2 µl starterów, 10 µl DNA o końcowym stężeniu 100 ng i 23 µl wody wolnej od nukleaz. Reakcję przeprowadzono w następujących warunkach amplifikacji: 1 cykl w temperaturze 94 ° C przez 5 minut, a następnie 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 50°C przez 45 sekund, 72°C przez 1 minutę i 1 cykl w temperaturze 72°C przez 5 minut. Następnie 1 µl produktu tej reakcji użyto jako szablon DNA do procedury gniazdowania, a startery i warunki amplifikacji były takie same dla fragmentu 275 bp.

wszystkie produkty amplifikacji zidentyfikowano za pomocą elektroforezy poziomej w 2% żelach agarozowych zabarwionych 0,5 µg/ml bromku metydyny i zobrazowano za pomocą transilluminatora UV.

do analizy testu immunochromatograficznego parwowirusa psów (CPV Ag), zestaw ANIGEN® (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea). Każdy test został przeprowadzony zgodnie z instrukcjami producenta.

próbki krwi Pobrano z żyły szyjnej za pomocą rurek vacutainer z EDTA jako antykoagulantem. Morfologia krwi (CBC) wykonywano za pomocą automatycznego licznika komórek (QBC Vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, U. S. A.). Filmy krwi zostały poplamione Wright-Giemsa i zbadane pod fotonikmikroskopem. Leukopenia była brana pod uwagę, gdy całkowita liczba krwinek była mniejsza niż 6 × 103/µl .

analiza wyników została przeprowadzona za pomocą macierzy dla zakodowanych zmiennych , a tabele awaryjne zostały stworzone w celu określenia właściwości testu diagnostycznego . Ponadto w statystykach Kappa zdecydowano się zawrzeć porozumienie między trzema wykorzystywanymi testami, a nPCR. Wartość kappa została scharakteryzowana według Kantere i współpracowników w 2015 r., gdzie wartość Kappa 1 oznacza Porozumienie bezwzględne, natomiast wartość 0 oznacza, że porozumienie występuje z powodu przypadku. Ogólnie rzecz biorąc,wartości Kappa wyższe niż 0,6 wskazują na dobry poziom porozumienia; analizę przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego SPSS Ver. 22.0 (IBM,Inc., Armonk, NY, U. S. A.).

dziewięćdziesiąt jeden punkt jeden (91,1) % psów z wynikiem pozytywnym dla CPV-2 przez nPCR było czystej krwi; 95.5% pacjentów było w wieku od 2 do 8 miesięcy, a 4,5% było starszych niż rok. Jeśli chodzi o ich status szczepienia, 40% zostało zaszczepionych co najmniej raz, aby zapobiec zakażeniu CPV-2.

częstość objawów klinicznych wykazywanych przez te psy była następująca: 44,4% wykazywało wymioty i biegunkę; 20% miało gorączkę, wymioty i biegunkę(nieżyty lub krwotoczne); 17,7% wykazywało tylko biegunkę; 8,8% wykazywało tylko wymioty; a 4,4% miało biegunkę i gorączkę, a 4,4% wykazywało wymioty i gorączkę.Leukopenię obserwowano u 48,8% psów (Tabela 1).

w badaniu klinicznym lekarze weterynarii zdiagnozowali tylko 57,8% pacjentów z pozytywnym wynikiem CPV-2 i 100% psów z negatywnym wynikiem; dlatego wartość czułości dla diagnozy klinicznej oszacowano na 57,7% (CI0.95 42,2–72), a obserwowana swoistość wynosiła 100% (CI0.95 46,2–98,8).

jeśli chodzi o diagnostykę badań laboratoryjnych, spośród 100% psów, które uzyskały wynik dodatni dzięki nPCR, tylko 30/45 z tych pacjentów było dodatnich CPV – 2 dzięki testowi immunochromatograficznemu, podczas gdy pięciu pacjentów z grupy kontrolnej, u których wynik był negatywny na CPV-2, zostało prawidłowo zdiagnozowanych. Dlatego technika ta wykazała czułość 66,6% (CI0. 95 50,9-79,5), a obserwowana swoistość wynosiła 100% (CI0.95 46,2–98,8).

stosując technikę PCR, u 36/45 pacjentów uzyskano wynik dodatni na CPV-2, a u pięciu pacjentów z grupy kontrolnej wynik ujemny w całym nPCR. Tak więc, PCR wykazano jako czułość 80% (CI0.95 63,1–87,7) i swoistość 100% (Ci0.95 67,8–99,1) (Fig. 1).

zgodność między trzema technikami wykazuje się za pomocą wartości Kappa (Tabela 2).

zapalenie żołądka i jelit spowodowane przez CPV-2 jest uważane za jedną z głównych chorób wirusowych, które dotykają psy. Chociaż objawy kliniczne infekcji parwowirusem psów mogą się różnić, najczęściej zgłaszanymi objawami były: anoreksja, depresja, letarg ,gorączka, śluzowata i krwotoczna biegunka i leukopenia ; w przypadkach subklinicznych niektóre z tych objawów mogą lub nie być obecne .

podczas badania klinicznego obserwowano zmienność objawów klinicznych zakażenia. Tylko 20% badanych psów przedstawiało typowe objawy, jak powszechnie opisywane w literaturze. Zmienność kliniczna tej choroby była zgłaszana wcześniej, a niektórzy autorzy omówili takie czynniki, jak wiek, status immunologiczny, Droga narażenia, dawka wirusa, zjadliwość szczepów i współistniejące zakażenie innymi czynnikami zakaźnymi, jako możliwe przyczyny . Komplikuje to uzyskanie dokładnej diagnozy CPV – 2, gdy weterynarze polegają wyłącznie na badaniu klinicznym. Dlatego w odniesieniu do naszegoprowadzenie wyłącznie oparte na tej procedurze, 42,2% psów będzie miało fałszywie ujemną diagnozę CPV-2.Poprzez dokumentację medyczną psów w tym badaniu zaobserwowaliśmy, że weterynarze wykluczają możliwość zakażenia przede wszystkim dlatego, że psy nie wykazywały klasycznych objawów klinicznych opisanych w literaturze, były szczepione przeciwko CPV-2 i/lub były dorosłe. Jednak większość psów w naszych badaniach wykazywała nietypowe objawy. Dlatego uważamy, że subkliniczne infekcje CPV-2 są bardziej powszechne, a weterynarze, którzy muszą zdecydować, czy zastosować dodatkowe testy diagnostyczne o wysokiej czułości i swoistości, powinni uważnie rozważyć te ustalenia.

w tym badaniu u 40% pacjentów z dodatnim wynikiem CVP-2 zaszczepiono wcześniej. Powszechnie wiadomo, że technika PCR jest bardzo wrażliwa, a zatem wykrywa cząsteczki wirusa szczepienia w kale od niedawno zaszczepionych pacjentów; badania wskazują, że możliwe jest uzyskanie fałszywie dodatnich wyników od 3 do 10 dni szczepienia za pomocą zmodyfikowanej żywej szczepionki CPV . W związku z tym, aby przeprowadzić to badanie, wykluczono pacjentów ze szczepieniami w wywiadzie w ciągu ostatnich 15 dni. Dodatkowo,próbki od szczepionych psów z dodatnim wynikiem na CPV-2 zsekwencjonowano i we wszystkich badanych przypadkach zidentyfikowano genowariant CPV-2C (dane nie pokazują), co oznacza, że psy były zakażone polem CPV-2C, wiedząc, że w Meksyku nie ma jeszcze CPV-2CVACCINE. Ponadto w Meksyku Pedroza i współpracownicy donosili, że najczęstszym wariantem antygenowym u zakażonych psów był CPV-2C .

z drugiej strony wielu lekarzy weterynarii uważa obecność leukopenii, czynnika wspierającego diagnozę CPV – 2. Zaobserwowaliśmy jednak, że tylko 48.U 8% (22/45) badanych psów stwierdzono leukopenię podczas oceny, co jest zgodne z innymi doniesieniami wskazującymi, że około 50% psów nie wykazuje objawów hematologicznych w czasie oceny . W związku z tym CBC jest cennym narzędziem, które może dostarczyć informacji na temat ciężkości choroby, co sugeruje rokowanie i określenia odpowiedzi na leczenie. Leukopenii nie należy jednak traktować jako narzędzia diagnostycznego dla CPV-2, ponieważ nie dostarcza ona dowodów na obecność wirusa.

różne techniki identyfikacji wirusowej są używane do ostatecznego potwierdzenia zakażenia przez CPV-2, na przykład szybkie testy oparte na immunochromatografiach są szeroko stosowane przez lekarzy, ponieważ procedura jest łatwa, szybka i dostępna. Dodatkowo nie wymaga przygotowania próbki ani wysłania do specjalistycznego laboratorium do analizy. Różna czułość tego testu jest jego wadą; kilka badań wykazało , że jego czułość waha się od 50 do 100%, aw naszym badaniu czułość porównawcza z nPCR wynosiła 66,6%. Niektóre badania wykazały, że niska czułość techniki jest spowodowana koniecznością zrzucania dużych cząstek wirusa do stolca psów w celu uzyskania pozytywnej diagnozy . Należy ponownie rozważyć zastosowanie tej techniki, ponieważ oczekuje się większego prawdopodobieństwa fałszywie ujemnych wyników. Aby temu zapobiec,należy stosować dalsze techniki o wyższej wrażliwości .

kilka badań wykazało wysoką czułość testów opartych na PCR; obecnie istnieje wiele wariantów tej samej procedury, które oferują czułość od 80 do 100% . W niniejszym badaniu PCR miało 80% czułości i warto wspomnieć, że pacjenci byli tylko zidentyfikowani pozytywnie do infekcji przez nPCR, tymczasem ani PCR, ani testy immunochromatograficzne nie były w stanie go zidentyfikować.

w odniesieniu do wartości kappa porównaliśmy wyniki spośród trzech analizowanych metod z nPCR. Mimo to wykazano słabą zgodność między diagnozą kliniczną a npcr; zaobserwowano umiarkowaną zgodność między konwencjonalnymi PCR i nPCR, co może wynikać z podobieństwa między tymi dwoma testami.

jeśli chodzi o objawy kliniczne, u wszystkich pacjentów zakażonych wirusami obserwowano wymioty lub biegunkę, podczas gdy inne objawy kliniczne nie były uważane za istotne dla zakażenia; w zgodzie z objawami klinicznymi i wrażliwością stosowanych technik nie zaobserwowano żadnego związku. Na przykład przypadek nr 26 wykazał tylko wymioty jako znak kliniczny i został uznany za negatywny dla CPV-2 przez weterynaryjną diagnostykę kliniczną, jednak testy immunochromatograficzne, PCR i npcrtesty były pozytywne dla CPV-2. Co więcej, przypadki 41 i 42, w których głównym objawem klinicznym była biegunka, można było zdiagnozować tylko pozytywnie na CPV-2 przy użyciu nPCR.

nasze dane wskazują, że najczęściej stosowane testy diagnostyczne w klinicznych i diagnostycznych laboratoriach weterynaryjnych do wykrywania CPV-2 są wysoce specyficzne, ale ich czułość uniemożliwia dokładną diagnozę CPV-2. W naszym badaniu PCR i test immunochromatograficzny nie były tak czułe jak nPCR, co potwierdzono we wcześniejszych badaniach , jednak zastosowanie nPCR jako testu diagnostycznego nie jest jeszcze szeroko rozpowszechnione w szpitalach weterynaryjnych, podczas gdy pozostaje szeroko stosowane do celów badawczych.

z drugiej strony, PCR w czasie rzeczywistym, który jest również bardzo czuły, jest rzadko używany, ze względu na wysokie koszty sprzętu i wymóg wysoce wyspecjalizowanego personelu do jego obsługi. Jednak postęp technologiczny pozwolił na to, że techniki te stały się tańsze i prostsze w użyciu, co mogłoby doprowadzić do ich bezpośredniego zastosowania w szpitalach weterynaryjnych w celu poprawy dokładności diagnostycznej dla CPV-2.