porównanie konwencjonalnego odwapniania z metodą wspomaganą mikrofalowo w tkance kostnej dotkniętej Mycetoma

Streszczenie

Mycetoma jest trwającą całe życie ziarniniakową chorobą tkanek podskórnych i kości. Histopatologia jest uzasadnioną metodą orientacyjną opartą na założeniu ostatecznej diagnozy mycetoma. Wymaga wydajnego przetwarzania tkanek, w tym odwapnienia kości. Proces odwapniania musi zapewnić całkowite usunięcie wapnia, a także właściwe zachowanie zdolności barwienia tkanek i mikroorganizmów. Cele. Porównanie metody konwencjonalnej stosowanej w odwapnianiu z metodą mikrofalową wykorzystującą różne roztwory odwapniające. Zbadano różne cechy, w tym szybkość odwapniania oraz zachowanie morfologiczne i grzybicze w tkance kostnej dotkniętej mycetoma. Materiały i metody. Do usunięcia wapnia z 50 próbek tkanki kostnej dotkniętych mycetoma zastosowano trzy roztwory odwapniające, w tym 10% obojętny buforowany EDTA (pH 7,4), 5% kwas azotowy i 5% kwas solny. Zastosowano metody konwencjonalne i mikrofalowe. Do oceny morfologii kości i grzybów wykorzystano plamę hematoksylina-eozyna (HE), plamę Gridleya i plamę heksaminę-srebro Grocotta. Wyniki. Czas odwapnienia metodą konwencjonalną w porównaniu z metodą mikrofalową z 10% EDTA (pH 7,4) wynosił 120 godzin i 29 godzin, natomiast 5% kwasu solnego i 5% kwasu azotowego osobno 8 godzin i 3 godziny. Ponadto 10% EDTA jest najlepszym środkiem odkamieniającym do barwienia i plam grzybowych. 5% kwasu solnego i 5% kwasu azotowego można stosować do barwienia grzybów. Wniosek. W bieżącym badaniu badano wpływ różnych środków odkamieniających, a także dwóch procedur odkamieniania na zachowanie struktury kości i barwienie grzybicze, które pomogą opracować odpowiednie protokoły do analiz tkanki kostnej dotkniętej zakażeniem mycetoma.

1. Wprowadzenie

Mycetoma jest przez całe życie ziarniniakową, stopniowo szkodliwą epidemiczną chorobą skóry i tkanek podskórnych, która może przejść do głębszych struktur, takich jak mięśnie i kości i prowadzić do rozległego zniszczenia, głównie stóp, wymagającego szerokich lokalnych wycięć chirurgicznych lub amputacji kończyn . Mycetoma jest definiowana przez trywirat ekspansji, wyczerpujących zatok i istnienie ziaren kolonijnych w wysiękach zapalnych . Zakażenie jest klasyfikowane jako eumycetoma (zakażenie grzybicze) lub actinomycetoma (zakażenie bakteryjne) . Jest to zasadniczo stan regionów tropikalnych i półpustynnych, zauważalnie Sudanu . Ziarna upraw Madurella mycetomatis są ogromne, wynoszą od 0,5 do 3 mm i wydają się zaokrąglone, owalne lub trójlistne. Składają się z krzyżujących się strzępek zakorzenionych w śródmiąższowym brązowym cemencie, składających się z melaniny, czarno-brązowego pigmentu . Histopatologia jest szybką metodą orientacyjną, a także korzystnym procesem przy założeniu ostatecznej diagnozy choroby mycetoma i zawiera raport opisujący morfologiczną prezentację czynników sprawczych. Czynnik sprawczy nadal może być wyizolowany z tkanki kostnej. Odwapnienie jest podstawowym etapem, który jest powszechnie osiągany w badaniu histopatologicznym kości . Minerały w kościach składają się z wapnia i fosforu, a nierozpuszczalne sole stanowią ponad sześćdziesiąt procent tkanki kostnej . Minerały te zapewniają twardość kości i są przyczyną trudności podczas cięcia tkanek za pomocą mikrotomów obrotowych . Takie tkanki muszą być leczone w celu ekstrakcji fosforanu wapnia za pomocą procedury zwanej odwapnieniem, poprzez uczynienie tkanki wystarczająco delikatnej, aby mogła zostać przecięta przez mikrotom. Odwapnianie odbywa się przez kwasy, które tworzą rozpuszczalne sole wapnia lub czynniki chelatujące, które wiążą się z jonami wapnia. Obecne konwencjonalne metody odwapniania charakteryzują się pracochłonnymi procesami i uporczywym niepowodzeniem reakcji barwienia tkanek . W konwencjonalnej metodzie odwapniania tkanki kostne umieszcza się w płynie odwapniającym w temperaturze pokojowej ze zmianami roztworu w regularnych odstępach czasu, aż do osiągnięcia punktu końcowego. Odwapnienie mikrofalowe jest innowacyjną techniką w porównaniu z konwencjonalną metodą . W tym procesie tkanki stałe umieszcza się w roztworze odwapniającym w kuchence mikrofalowej na okresowy czas trwania ze zwykłymi przesunięciami płynów odwapniających do osiągnięcia punktu końcowego. Promieniowanie mikrofalowe przeprowadzono w celu przyspieszenia procedury odwapnienia w przybliżeniu z dni na godziny . Celem pracy było porównanie metody konwencjonalnej stosowanej w odwapnianiu ze zmodyfikowaną metodą mikrofalową wykorzystującą różne roztwory odwapniające. Zbadano różne cechy, w tym szybkość odwapniania oraz zachowanie morfologiczne i grzybicze w tkance kostnej dotkniętej zakażeniem Madurella mycetomatis.

2. Materiały i metody

jest to eksperymentalne badanie opisowe mające na celu porównanie konwencjonalnej procedury odwapniania z odwapnianiem wzmocnionym mikrofalowo w odniesieniu do morfologii tkanek dotkniętych zakażeniem mycetoma przy użyciu hematoksyliny i eozyny, gridleya i plam heksaminowo-srebrnych Grocott w celu pełnej identyfikacji organizmów przyczynowych madurella mycetomatis. Badania przeprowadzono w Mycetoma Research Center w Szpitalu Uniwersyteckim w Soba oraz na Wydziale Nauk Medycznych Uniwersytetu Al Neelain. Od wszystkich pacjentów uzyskano pisemną, świadomą zgodę. Zebrano 50 amputowanych kończyn dotkniętych mycetomą. Biopsje kości wycinano za pomocą odpowiedniej piły na kawałki o grubości 5 mm, a następnie utrwalano w 10% soli fizjologicznej przez 48 godzin. Były myte pod bieżącą wodą z kranu przez 30 minut, aby usunąć utrwalacz.

2.1. Konwencjonalna procedura odwapniania

trzy kawałki biopsji kostnych o grubości 5 mm zanurzono w trzech 250 ml zlewkach Pyrex Squat, z których każda zawiera 100 ml 5% wodnego kwasu solnego (HCl), 5% wodnego kwasu azotowego (HNO3) i 10% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), umieszczonych w temperaturze pokojowej (średnia 28°C), patrz Tabela 1. Punkt końcowy odwapnienia sprawdzano metodą szczawianu wapnia dla dwóch dekalcyfrów kwasowych (5% HNO3 i 5% HCl) po dwugodzinnej przerwie w następujący sposób: Pobrano 5 ml zużytego płynu odwapniającego i umieszczono w probówce, następnie dodano papier lakmusowy i dodawano wodorotlenek amoniaku kropla po kropli, aż papier lakmusowy zmieni się, wskazując, że alkaliczny płyn odwapniający był czysty. Dodano 5 ml nasyconego roztworu szczawianu amonu, gdy roztwór odwapniający stał się mętny, wskazując na obecność wapnia w tkance kostnej, tak że roztwór odwapniający zastąpiono nowym roztworem, a proces powtarzano co 30 minut do zakończenia procesu odwapniania. W przypadku EDTA zastosowano fizyczne testy kalkulacji, w których uznano, że proces odwapniania zakończył się, gdy kość została łatwo przebita przez igłę. Średni całkowity czas odwapnienia wynosił odpowiednio 7 godzin i 30 minut, 8 godzin i 120 godzin dla 5% kwasu azotowego, 5% HCl i 10% EDTA.

2.2. Kuchenka mikrofalowa

zastosowano kuchenkę mikrofalową domową (Midea Microwave 20L, 700w, Digital, EM720CFF) z nieruchomą płytą obrotową. Szklaną zlewkę zawierającą 100 ml wody destylowanej podgrzewano przez 5 sekund w celu ogrzania magnetronu. Zastąpiono ją 100 ml świeżej wody destylowanej i napromieniowano, aby utrzymać temperaturę na poziomie około 41-43°C. trwało to 15 sekund. Zlewka szklana została przydzielona w różnych punktach piekarnika podczas napromieniowywania, aby ustalić najlepszą lokalizację próbki podczas odwapniania mikrofalowego, ponieważ używana kuchenka mikrofalowa miała stały czas, ale nie stałą temperaturę. Trzy kawałki biopsji kostnych o grubości 5 mm zanurzono w 250 ml zlewek Pyrex Squat zawierających 100 ml 5% wodnego kwasu solnego (HCl), 5% wodnego kwasu azotowego (HNO3) i 10% EDTA. Następnie przeniesiono je do kuchenki mikrofalowej, a próbki napromieniowywano przez dziesięć cykli po dziesięć sekund każdy (w odstępach 15-minutowych) przez łączny czas 2-4 godzin dla dekalcyfrów kwasowych (5% HNO3 i 5% HCl). Temperatura roztworu odwapniającego utrzymywała się na poziomie około 41-43°C. sprawdzano roztwór odwapniający i punkt końcowy odwapnienia, a roztwór odwapniający był wielokrotnie zmieniany aż do zakończenia odwapniania. Punkt końcowy odwapnienia sprawdzano za pomocą szczawianu wapnia i testów fizycznych jak wyżej. Średni całkowity czas odwapnienia wynosił odpowiednio 3 godziny i 45 minut, 5 godzin i 30 minut oraz 29 godzin i 4 minuty dla 5% kwasu azotowego, 5% HCl i 10% EDTA. Po całkowitym odwapnieniu tkanki przemyto wodą destylowaną i przeniesiono do 0,3% roztworu amoniaku na 5 minut w celu zneutralizowania użytego kwasu.

2.3. Przetwarzanie tkanek i barwienie

próbki poddano automatycznemu przetwarzaniu tkanek przy użyciu następujących protokołów: biopsje kości umieszczano w 10% soli fizjologicznej na jedną godzinę. Następnie 50% alkoholu na godzinę, 70% alkoholu na godzinę, 90% alkoholu na godzinę, następnie 100% alkoholu trzy zmiany po dwie godziny każda, ksylen dwie zmiany, każda na półtorej godziny, wreszcie parafina dwie zmiany każda na dwie godziny. Tkanki osadzano w blokach parafinowych i sekcjowano do grubości 5-6 µm za pomocą mikrotomu obrotowego. Sekcje zostały zabarwione hematoksyliną Mayera, opisaną przez Mayera w 1903, a przeciwstaina w każdym wynosiła 1% eozyny (HE) . Plama Gridley 'a została użyta do demonstracji grzybów opisanych przez Gridley’ a w 1953 roku); po deparaffinizacji i ponownym nawodnieniu fragmenty tkanek umieszczono w 2% kwasie chromowym na 30 minut. Następnie zostały dobrze przemyte wodą z kranu, spłukane wodą destylowaną, a następnie umieszczone w odczynniku Schiffa na 20 minut. Następnie przemywano je bieżącą wodą z kranu przez 10 minut i płukano 70% etanolem, a następnie 95% etanolem. Zostały one skontrowane Metanilem Żółtym przez jedną minutę i dobrze spłukane wodą destylowaną. Następnie odwodniono je w ksylen i zamontowano w distyrenie, plastyfikatorze i ksylenie (DPX). Następnie sekcje zbadano pod mikroskopem . Ponadto zastosowano metodę heksaminowo-srebrną Grocott dla grzybów opisaną przez Grocott w 1955 r., w której sekcje utleniono 4% wodnym kwasem chromowym przez godzinę, przemyto w wodzie przez kilka sekund, potraktowano 1% metabisiarczynem sodu przez jedną minutę, przemyto w bieżącej wodzie z kranu przez 3 minuty, dokładnie spłukano w wodzie destylowanej, umieszczono w podgrzanym roztworze srebra roboczego w łaźni wodnej w temperaturze 60°C przez 20 minut, dobrze spłukano w wodzie destylowanej, przemyto bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, kontrastowano w 15 sekund, odwodniony i oczyszczony w ksylen i zamontowany w DPX, a w końcu zbadane pod mikroskopem.

2.4. Ocena wyników

sekcji została oceniona przez eksperta histopatologa. Oceniano i oceniano również jakość procesu odkamieniania oraz wynik barwienia, a jakość odkamieniania oceniano według następujących kryteriów: czas odkamieniania, zachowanie morfologiczne morfologii tkanek oraz grzyby Madurella mycetomatis przez HE; barwienie metodą Gridley i Grocott methenaminowo-srebrną oceniano od 1 do 4 (1: słaby, 2: sprawiedliwy, 3: Dobry i 4: doskonały) .

2.5. Analiza statystyczna

analiza danych została przeprowadzona za pomocą programu SPSS. Jednokierunkowa ANOVA została użyta do udowodnienia wpływu trzech roztworów odwapniających na ilościową analizę jakości sekcji i zachowania grzybów. Test Kruskala-Wallisa przeprowadzono w celu ustalenia, czy istniała znacząca różnica między testowanymi rozwiązaniami dla każdego z ocenianych parametrów wraz z dwoma eksperymentami. Różnice z interpretowano jako istotne statystycznie.

3. Wyniki

do badania włączono 50 przypadków madurella mycetomatis z czarnym ziarnem. Stopy były najbardziej dotkniętym regionem anatomicznym w 48 przypadkach (96%) i dwóch przypadkach (4,0%) w dłoni. Jeśli chodzi o czas odwapniania w różnych eksperymentach, spośród trzech badanych roztworów, odwapnianie przy użyciu 10% EDTA (pH 7,4) zajęło najdłuższy czas dla metody konwencjonalnej (do 120 godzin w porównaniu do 29 godzin w mikrofalówce), a stosowanie kwasu odwapniającego zajęło najkrótszy czas w zakresie od 8 godzin do 3 godzin dla różnych metod odwapniania. Jakość morfologii tkanek różnych typów roztworu odwapniającego metodą mikrofalową odwapniającą w porównaniu z metodą konwencjonalną z barwieniem hematoksyliną Mayera i eozyną w odniesieniu do wyglądu jądrowego i cytoplazmatycznego uzyskiwała zmienne wyniki. Ponadto, 10% Kości dekalcyfikowanej EDTA wydaje się mieć znacznie lepszy wynik (wartość P przy użyciu testu chi-kwadrat: 0,023) w porównaniu z 5% HNO3 i 5% HCl. Doskonały raport barwienia wyniósł 43 (86%) w porównaniu 32 (64%), 42 (84%) odpowiednio w porównaniu z 18 (36%) i 33 (66%) w porównaniu z 1 (2%). Metoda Grocott methenamine-silver stain została użyta do wykazania czynnika sprawczego madurella mycetomatis w odniesieniu do morfologii i jasności grzybów, a sekcje tkankowe odwapnione 10% EDTA, 5% HNO3 i 5% HCl przy użyciu metod konwencjonalnych i mikrofalowych wykazały znacznie lepszą morfologię grzybów (wartość P przy użyciu testu chi-kwadrat: 0,001) w następujący sposób: 33 (66%) w porównaniu z 32 (64%), 33 (66%) odpowiednio w porównaniu z 39 (78%) i 22 (44%) w porównaniu z 31 (62%). Inną plamą grzybiczą stosowaną w przypadku Produktu Madurella mycetomatis była plama Gridleya dotycząca morfologii grzybów i jakości barwienia kości odwapnionych 10% EDTA, 5% HNO3 i 5% HCl przy użyciu metod konwencjonalnych i mikrofalowych, która wykazała znacznie lepsze wyniki (wartość P przy użyciu testu chi-kwadrat: 0,003) w następujący sposób: 43 (86%) w porównaniu z 41 (82%), 32 (64%) odpowiednio w porównaniu z 34 (68%) i 23 (46%) w porównaniu z 35 (70%). Wyniki te podsumowano w tabeli 2. Rysunek 1 przedstawia wyniki barwienia przy użyciu różnych środków i warunków odwapniających.

1

demonstracja wyników barwienia przy użyciu różnych środków i warunków odkamieniania.

4. Dyskusja

histopatologiczna identyfikacja czynnika sprawczego madurella mycetomatis jest dobrze ugruntowana, ponieważ jest to złota procedura standardowa; jednak twarda tkanka i kość wymagają specjalnego odwapnienia w celu zachowania struktury tkankowej i morfologii czynnika sprawczego. Czynniki sprawcze można zidentyfikować za pomocą hematoksyliny i eozyny (HE) oraz specjalnych plam grzybów, więc kość wymaga standardowego protokołu odwapniania, który zachowuje tkankę, morfologię czynnika sprawczego i zdolność plam. Odwapnienie kości jest techniką żmudną. Wymaga to tygodni, a zachowanie konfiguracji tkanki zależy od doskonałości i szybkości procedury odwapniania. Nowatorski proces za pomocą kuchenki mikrofalowej został zrealizowany w celu przyspieszenia procesu odwapniania . Wybór środka odwapniającego i sposobu zależy zasadniczo od rzetelności metody, a możliwe zastosowania energii mikrofalowej w technikach histologicznych zostały po raz pierwszy udokumentowane przez Mayersa w 1970 roku. Ten system nieujonizowania metody emisji, który miał przyspieszyć proces odwapniania . Kinetyka molekularna powoduje następnie wytwarzanie zmiany energii, która trwa do momentu zatrzymania promieniowania . W tym badaniu, czasy odkamieniania zgłoszone dla odwapnienia wzmocnionego mikrofalami i konwencjonalnej procedury odkamieniania wynosiły odpowiednio 29 i 120 godzin z 10% EDTA (pH 7,4), trzy godziny i siedem godzin z 5% kwasem azotowym oraz pięć i osiem godzin z 5% HCl. Oczywiste jest, że metoda odwapniania mikrofalowego dla tkanki kostnej dotkniętej zakażeniem mycetoma była znacznie szybsza niż metoda konwencjonalna. Ponadto 5% kwasu azotowego miało szybszą zdolność odwapniania, a następnie 5% kwasu solnego, a następnie EDTA (pH 7,4) dla obu metod. Pitol i in. użyłem domowej kuchenki mikrofalowej do usuwania wapnia z kości szczura o 8,5% roztworu EDTA i wykazałem skrócenie okresu próbnego z 45 dni w procesie konwencjonalnym do 48 godzin w procesie wspomaganym mikrofalowo. W tej pracy 10% roztwór EDTA trwał 120 godzin w konwencjonalnej metodzie i 29 godzin przy użyciu mikrofal w celu osiągnięcia całkowitego odwapnienia tkanki kostnej dotkniętej zakażeniem mycetoma. Stężenie EDTA w naszym eksperymencie było więcej niż Pitol et al.to nauka. Oprócz różnic w wielkości, grubości i rodzajach kości, mogą to być możliwe wyjaśnienia wydłużenia czasu odwapnienia w Pitol et al.badania, które zostały zredukowane w naszym otoczeniu. Ponadto odwapnienie kości dotkniętej zakażeniem mycetoma metodą konwencjonalną przy użyciu 5% kwasu azotowego zajęło siedem godzin, podczas gdy metoda w kuchence mikrofalowej trwała trzy godziny. Porównywalne wyniki osiągnęły Balaton i Loget . Ponadto w tych badaniach czasy dekalcyfikacji zostały skrócone z innych badań. Czasy odkamieniania zgłaszane dla metod konwencjonalnych i mikrofalowych wynosiły od jednego dnia i czterech godzin do 5 dni i są uważane za niskie w porównaniu z innymi badaniami kości gryzoni, w których odnotowano czasy od 2 do 7 dni z roztworami odkamieniania kwasu i 10% EDTA (pH 7,4), odpowiednio . Shibata i jego grupa zgłaszali prawie podobne czasy odwapniania, które wahały się od 1 dnia do 7 dni z 10% HCl, 10% kwasem azotowym i 10% EDTA. Używali jednak dekalcyfierów kwasowych o wyższych stężeniach . Uma i in. oceniono działanie czterech różnych płynów odwapniających za pomocą odwapnienia mikrofalowego w kości szczura i zgłoszono 1 do 1,5 dnia dla 5% kwasu azotowego i 7% HCl/2% EDTA. Jednakże 10% EDTA trwało od 14 do 26 dni w zależności od rodzaju Kości . W badaniach tych rodzaj, charakter i wielkość kości były różne i różniły się od analizowanych tutaj. Zabieg odwapniania był kluczowym powodem wyższości sekcji tkankowej i precyzji barwienia. Philipp et al. (2019) opisał, że metoda dekalcyfikacji powoduje znaczące zmiany morfologiczne, które zmieniają strukturę białka i wpływają na zdolność barwienia tkanki . W naszym badaniu kość leczono 5% kwasem azotowym metodą rutynową manualną, a w tkance miękkiej stwierdzono obrzęk i utratę barwienia jądrowego i grzybiczego w porównaniu z odwapnianiem wspomaganym mikrofalowo. Kwasowe środki odwapniające Zwykle zaburzają stałość kości i tkanek miękkich. Te efekty specjalne w 5% kwasie azotowym są ze względu na czas i kwasowość roztworu. Tak więc szybsze odwapnienie spowoduje większe obrażenia i większe efekty W H& E i specjalnej plamie grzybiczej. Kilka grzybów można wykazać za pomocą sekcji histologicznej przy użyciu plam histochemicznych, takich jak plama Methenaminowo-Srebrna (GMS) Grocotta i/lub plama Gridleya (GS). Niektóre grzyby można dokładnie wykazać w tkankach na podstawie struktur morfologicznych; jednak skuteczność rozpoznawania zmniejszała się po długotrwałym utrwaleniu i odwapnieniu przy użyciu konwencjonalnych metod . W tym badaniu odwapnienie wspomagane mikrofalą dało lepsze barwienie w porównaniu z konwencjonalną metodą morfologii z użyciem H&E i specjalnej plamy grzybowej, w której 10% EDTA było rozwiązaniem, które najlepiej zachowało struktury tkankowe i zdolność barwienia grzybów pomimo długiego czasu na odwapnienie.

5. Wnioski i zalecenia

Odwapnianie wzmocnione przez zastosowanie kuchenki mikrofalowej jest nową techniką odwapniania. Technikę tę badano w tkance kostnej dotkniętej zakażeniem Madurella mycetomatis przy użyciu 10% EDTA, 5% kwasu azotowego i 5% kwasu solnego jako płynów odwapniających. Porównano to z konwencjonalną odwapnianiem w temperaturach pokojowych w celu określenia szybkości odwapniania i morfologii tkanek za pomocą Hematoksyliny i eozyny Mayera dla struktury kości oraz plam Grocotta i Gridleya dla morfologii grzybów. Lepsze wyniki uzyskano w porównaniu z metodą konwencjonalną, zarówno w morfologii komórek, jak i zarodników grzybów i strzępek o obniżonej jasności grzybów w temperaturze pokojowej. Odkrycie to może pomóc w opracowaniu odpowiednich protokołów analizy tkanki kostnej dotkniętej zakażeniem mycetoma.

6. Ograniczenia niniejszego badania

większa wielkość próby dałaby bardziej rozstrzygające wyniki. Ponadto, czasy podjęte dla odwapnienia mogą być różne, jeśli używane są różne masy kości i próbki kości inne niż ręce, ponieważ czas odwapnienia zależy od wielkości i gęstości strukturalnej tkanki twardej. Wreszcie, ponieważ korzystaliśmy z domowej kuchenki mikrofalowej, nasze zapisy temperatury mogły być tylko przybliżone.

dostępność danych

zbiory danych wygenerowane podczas bieżącego badania są dostępne od odpowiedniego autora na uzasadnione żądanie.

zatwierdzenie etyczne

badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Faculty of Medical Laboratory Science, University of Al Neelain.

konflikty interesów

autor oświadcza, że nie ma konfliktów interesów.

podziękowania

autor pragnie wyrazić swoją szczerą wdzięczność pracownikom Mycetoma Research Centre, University of Chartum, Chartum, Sudan, A szczególne uznanie dla profesorów Ahmeda Hassana Fahala i Ahmeda Mohammeda El Hassana, emerytowanego profesora patologii, za ich pomoc.

Materiały uzupełniające

materiały i odczynniki użyte do potwierdzenia wyników tego badania są zawarte w informacji uzupełniających. (Materiały Uzupełniające)