raporty onkologiczne

wprowadzenie

chociaż nowe terapie zostały niedawno wprowadzone do praktyki klinicznej w leczeniu zaawansowanego raka prostaty, Rak prostaty pozostał drugim śmiertelnym rakiem u mężczyzn w Stanach Zjednoczonych w 2014 r. (1). Pilnie potrzebne są nowe cele i strategie terapeutyczne w celu dalszej poprawy wyników klinicznych pacjentów z rakiem prostaty.

obiecującym potencjalnym celem terapeutycznym jest kinaza 5 zależna od cykliny (CDK5). CDK5 jest kinazą serynowo-treoninową strukturalnie podobną do innych CDK (2). Wydaje się, że CDK5 nie ma majorrolu w regulacji cyklu komórkowego (3,4). Został dobrze scharakteryzowany ze względu na dominującą rolę wrozwoju ośrodkowego układu nerwowego, w tym rolę migracji inneuronalnej, różnicowania i adhezji (5,6). MYI inni następnie wykazali, że CDK5 odgrywa ważną rolę w rozwoju raka i przerzutów (7-12). W komórkach raka prostaty wykazaliśmy, że CDK5 jest krytyczny dla integralności mięśniowo-szkieletowej, migracji i inwazji komórek oraz invivo dla przerzutów (7). W nowotworze nowotworowym CDK5 jest nieodłącznym elementem sygnalizacji KRAS poprzez centralnie ważny szlak transdukcji sygnału RAL, zapewniając w ten sposób potencjalny „lekowalny” cel dla zmutowanych guzów KRAS (8). Łącznie badania te wskazują, że hamowanie CDK5, w monoterapii lub w skojarzeniu z innymi lekami, może zapewnić skuteczną strategię terapeutyczną dla tych i innych typów nowotworów.

w niniejszym badaniu postanowiliśmy zidentyfikować czynniki, które byłyby szczególnie skuteczne w połączeniu z zahamowaniem Cdk5 w komórkach raka prostaty. W związku z tym, wykonaliśmy ascreen z Johns Hopkins Drug Library (JHDL). Jhdl jest zbiorem 3360 związków farmaceutycznych, które pomyślnie przeszły testy bezpieczeństwa u ludzi w różnych zastosowaniach (13,14). Biblioteka ta została z powodzeniem wykorzystana do ponownego zastosowania związków do terapii nowotworowej, w tym identyfikacji digoksyny jako inhibitora HIF1a (15) i itrakonazolu jako inhibitora angiogenezy (16). Wcześniej wykorzystaliśmy JHDL w celu identyfikacji bromku cetrimonium i irynotekanu o zwiększonej aktywności przeciwnowotworowej przeciwko komórkom raka prostaty wykazującym niski poziom genu supresorowego przerzutów N-mycdownregulated genu 1 (NDRG1) (17).Tutaj przeprowadziliśmy podobne badania przesiewowe JHDL z komórkami raka prostaty, które różnią się aktywnością CDK5. Tiloron został zidentyfikowany jako związek z syntetyczną śmiertelnością in vitro z niedoborem komórek raka gruczołu krokowego inCDK5.

materiały i metody

hodowla komórkowa

linie komórkowe PC3 raka prostaty uzyskano z ATCC. Komórki te pochodzą z przerzutów do kości u 62-letniego pacjenta z rakiem prostaty. Ludzkie fibroblasty prostaty, zaproponowane przez Dr J. Isaacsa, uzyskano z biopsji prostaty u 62-letniego pacjenta z rakiem prostaty z wynikiem Gleasona 4. Linie Bothcell były hodowane i utrzymywane w pożywce Rpmi-1640 (Invitrogen)uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. Komórki hodowano w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% Co2atmosferze.

utworzenie linii komórek CDK5DN PC3

utrata funkcji CDK5 została dokonana w komórkach PC3 przez transfekcję dominująco-ujemnego konstruktu zawierającego D144nmutację, uprzejmie dostarczoną przez Dr L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Użyty protokół został wcześniej opisany (7). W skrócie,konstrukcja została subklonowana w dwukierunkowym wektorze Tet, pBI-EGFP (BD Biosciences), który miał Gen oporności na zeocinę dodany do selekcji (uprzejmie dostarczone przez Dr K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School Of Medicine). PBI-EGFP pusty wektor lub PBI-EGFPCDK5dn wektor transfekowano do komórek PC3, które zawierały ATET-Off promotor construct, pTTa (BD Biosciences).

Western blotting

Western blotting przeprowadzono zgodnie z opisem (19). Na żel załadowano 10 mikrogramów białka. Pierwotne przeciwciała rozpuszczono w buforze blokującym . Dla anty – CDK5 (Sigma-Aldrich) zastosowano rozcieńczenie 1:1000; anty-winkulinę (Millipore,Upstate) rozcieńczono 1: 4000. Przeciwciała wtórne rozcieńczono w rozcieńczeniu ata 1:4 000. Normalizacja intensywności pasma odbywała się za pomocą białka winkuliny. Opracowane plamy były skanowane za pomocą skanera Microtek.

test gojenia ran

testy gojenia ran przeprowadzono z użyciem kontrolki confluentPC3 (zawierającej pusty wektor PBI-EGFP) lub komórek CDK5DN PC3. Skrobak z gumową końcówką został użyty do zeskrobania powierzchni komórek. Natychmiast zarejestrowano lekkie obrazy mikroskopowe i 24 haft.

biblioteki małocząsteczkowe

biblioteka JHDL została wcześniej opisana(13,14,17).Przechowywanie i badanie przesiewowe związków JHDL przeprowadzono jak opisano wcześniej (17).Krótko mówiąc, komórki PC3 control i CDK5dn zostały osadzone w 96-studzienkowych płytkach (1×103 komórki / studzienkę) i pozostawiono do przylegania przez noc. Następnie dodano 5 µl leków, przechowywanych jako roztwory podstawowe 200 µM inDMSO / H2O, aby uzupełnić media RPMI, tak aby komórki były traktowane w końcowym stężeniu 10 µM. Po 48 godzinach leczenia do każdego z nich dodano 20 µl odczynnika MTS z testu proliferacji komórek wodno-promieniotwórczych CellTiter 96™ na czas 2-4 godzin w temperaturze 37°C. Płytki analizowano za pomocą czytnika płyt Asoftmax Pro (Molecular Devices). Proliferację komórek leczonych porównano z proliferacją komórek PC3control leczonych DMSO lub CDK5dn (wskaźnik proliferacji). Porównano metody proliferacji komórek PC3 CDK5dn z metodami proliferacji komórek kontrolnych PC3. Przeprowadzono badanie PubMed, aby ocenić kliniczne wykorzystanie potencjalnych trafień.

testy MTS

przeprowadzono testy MTS w celu pomiaru antyproliferacyjnego wpływu leczenia tiloronem. Tiloronedihydrochloride (Sigma-Aldrich) przechowywano w DMSO w temperaturze -20°C w postaci 10 mM zapasów. Tysiąc komórek PC3 pokryto 96-studzienkowymi płytkami zawierającymi 100 µl kompletnych nośników RPMI. Przy około 50% zbiegu podawano dichlorowodorek tiloronu. Forexperiments związek rozcieńczono w pełnych mediach RPMI, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe. Po leczeniu przez 72 godziny (monoterapia tiloronem) dodano odczynnik MTS i oznaczono absorpcję przy 490 nm za pomocą czytnika płyt SoftMax Pro.Obliczono wskaźniki proliferacji; jako acontrol użyto nieleczonych komórek kontrolnych PC3 lub cdk5dn (w 103 µl pełnych nośnikach RPMI). Testy t ucznia przeprowadzono w celu oceny wartości P.

testy Klonogenne

przeprowadzono testy Klonogenne w celu oceny długotrwałego wchłaniania po leczeniu tiloronem. Komórki raka gruczołu krokowego umieszczono w naczyniach o średnicy 60 mm i pozostawiono do przylegania. Przy zbiegu 50-60% komórki traktowano tiloronem przez 72 godziny. następnie 1 × 103 komórki z każdej naczynia platerowano w trzech egzemplarzach w naczyniach 60 mm i inkubowano w pełnych mediach RPMI przez 12 dni.Kolonie utrwalano i barwiono roztworem zawierającym 90%metanolu i 10% roztworu fioletu krystalicznego (2,3% fioletu krystalicznego, 0,1% szczawianu amonu i 20% alkoholu etylowego; Sigma). Kolonie były skanowane za pomocą skanera komputerowego (Microtek) i liczone ręcznie.Testy t ucznia przeprowadzono w celu oceny, czy różnice między liniami komórkowymi były statystycznie istotne.

3D Growth assay

3D Growth assays wykonywano z wykorzystaniem tego samego protokolu, jak opisano wcześniej (17). Krótko mówiąc, sferoidy zostały wytworzone przez wytworzenie komórek PC3 przez 16 godzin jako wisząca kropla nad nawilżoną płytką w inkubatorze CO2 w kompletnym mediakonie rpmi zawierającym 0,5% metylocelulozy. Sferoidy zostały osadzone w matrycy incollagen (BD Biosciences), leczone tiloronem i zobrazowane przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse ti (Nikon) w dniu leczenia i sześć dni po rozpoczęciu leczenia. Obszary sferoidalne i całkowite (spheroidplus sprouts) mierzono za pomocą ImageJ. Zwiększenie krotności obliczono dzieląc powierzchnię sferoidalną / całkowitą w dniu 6 przez powierzchnię sferoidalną / całkowitą w dniu 0 dla każdej pojedynczej sferoidy. Dla każdej linii i punktu czasowego zwiększono fałdowanie czterech sferoidów. Analizy statystyczne przeprowadzono z wykorzystaniem testów studenckich.

wyniki

zahamowanie aktywności CDK5

komórki raka gruczołu krokowego PC3 zostały wybrane do badania JHDLcompound screen ze względu na ich duży potencjał przerzutowy i niezależność od androgenów, przypominając tym samym agresywnego raka gruczołu krokowego opornego na przerzuty. Aktywność CDK5 hamowano przeztransfekcję i selekcję mutacji dominująco-ujemnej (CDK5144N). Te komórki PC3 CDK5dn miały wyższy poziom białka totalCDK5 w porównaniu z komórkami kontrolnymi PC3(komórki PC3 transfekowane pustym wektorem) (Fig. 1a). Test uzdrawiania (8) potwierdził, że CDK5 był funkcjonalnie nieaktywny w tych komórkach; w przeciwieństwie do komórek PC3control, komórki PC3 CDK5dn nie miały zdolności do inwazji zeskrobanej powierzchni (Fig.1B).

ekran biblioteczny dla związków ukierunkowanych na komórki PC3 w oparciu o aktywność CDK5

przeprowadzono wysokoprzepustowy test przesiewowy w celu wybrania związków docelowych dla komórek PC3 w oparciu o aktywność CDK5. Komórki PC3control i CDK5dn traktowano wszystkimi związkami jhdl w temperaturze 10 µM przez 48 godzin. Aby zidentyfikować trafienia, które selektywnie celują w komórki PC3 na podstawie ekspresji CDK5, wybraliśmy wszystkie związki, w których wskaźnik proliferacji (CDK5dn / control)był poniżej 0,5 lub powyżej 1,5 (rys. 2A).Co więcej, trafienia musiały hamować proliferację komórek PC3 o co najmniej 10%, ponieważ interesowały nas szczególnie związki hamujące wzrost komórek (pozioma i pionowa linia na wykresie). Wyselekcjonowano również wszystkie związki, które hamowały proliferację komórek inPC3 o 70% (lewy dolny róg wykresu), ponieważ byliśmy zainteresowani identyfikacją potencjalnych wysoce skutecznych środków przeciwnowotworowych. Łącznie do dalszej oceny wybrano 41 trafień.

przeprowadzono drugi ekran, w którym wybrane elementy z głównego ekranu zostały dodane w 10 µM przez 48 godzin do komórek PC3control i CDK5dn w trzech egzemplarzach, w celu wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich (rys. 2b). Wartości odcięcia były nieco mniej rygorystyczne niż na głównym ekranie; składy były uważane za trafienie, gdy stosunek wskaźników proliferacji(CDK5dn/control) był poniżej 0,7 lub powyżej 1,4. Doprowadziło to do identyfikacji trzech związków, które selektywnie celują w komórki PC3 wyrażające cdk5: rutilantin, mleczan etakrydyny i chlorek tetalkoniowy (Fig. 2C).Związki te nie były stosowane jako leki przeciwnowotworowe, a ich potencjalne zastosowanie kliniczne jako dożylnych środków przeciwnowotworowych wydaje się ograniczone (20-23). Inny związek, tiloron analogR9536-DA, był wysoce skuteczny w hamowaniu obu izogennych linii komórkowych PC3 (> 70% hamowania), ale nieco skuteczniej hamował proliferację komórek PC3CDK5dn (stosunek CDK5dn/Kontrola:0,687). Tiloron i jego analogi wykazują aktywność przeciwwirusową, działającą przynajmniej częściowo jako induktory interferonu (24-26), a także wykazano przedklinicznie i klinicznie aktywność przeciwnowotworową (27,28).

Tiloron selektywnie celuje w komórki PC3 z niską aktywnością CDK5

kontynuowaliśmy nasze eksperymenty ze świeżo rozpuszczonym dichlorowodorkiem tiloronu. Po 72 godzinach leczenia tiloronem w różnych stężeniach jego IC50 ustalono przy 8-12 µm w komórkach PC3 CDK5dn i 15 µM w komórkach kontrolnych PC3 w testach MTS (Fig. 3A). Przy 8 µM aktywność proliferacji zmniejszyła się odpowiednio o 24 i 47% w grupie kontrolnej PC3 i komórkach Cdk5dn (p=0,001). Aby ocenić toksyczność innormalnych komórek stercza tiloronu, przeprowadzono testy MTS z zastosowaniem tiloronetreatment ludzkich fibroblastów prostaty (Fig. 3b). Wrażliwość tych komórek na tiloron była podobna do wrażliwości komórek kontrolnych PC3.

hamujące działanie tiloronu w komórkach PC3 oceniano dalej, wykonując testy klonogenne (Fig. 3C). W tym teście komórki PC3 CDK5dn były również znacznie bardziej wrażliwe na tiloron niż komórki kontrolne PC3. Leczenie tiloronem o wielkości 10 µM prowadziło do powstania 40% w komórkach PC3 CDK5dn i 72% w komórkach kontrolnych PC3(p=0,002).

przeprowadzono test wzrostu kulistego w celu oceny wzrostu 3dtumoru i inwazji komórek PC3 podczas leczenia tiloronem (Fig. 4). Zarówno komórki PC3 control, jak i PC3CDK5dn miały porównywalny wzrost wielkości sferoidów w ciągu sześciu dni. Jednakże całkowita wielkość (wielkość sferoidów plus kiełków) powodowała większy wzrost liczby komórek kontrolnych PC3, co potwierdza, że komórki PC3 cdk5dn poddane obróbce miały Zmniejszony potencjał inwazyjny w porównaniu z komórkami kontrolnymi PC3. Gdy tiloron podawano w dawce 5µM, sferoidy kontrolne PC3 miały podobny wzrost i inwazyjny wzór jak nieleczone komórki kontrolne PC3 (P=0,59) (Fig. 4B, lewy Wykres). Jednakże, gdy chloron podawano w tym samym stężeniu komórkom PC3 Cdk5dn, zaobserwowano znaczny spadek zarówno wielkości kulistej, jak i całkowitej wielkości (p<0,01), co sugeruje, że tiloron skutecznie hamuje wzrost kulistego i inwazję komórek PC3 CDK5dn po podaniu w dawce 5 µM (Fig. 4B, Prawy wykres). Przy 10 µM obie izogeniczne linie komórkowe miały Zmniejszony potencjał.

dyskusja

JHDL, biblioteka dobrze scharakteryzowanych związków farmaceutycznych, została opracowana w celu ułatwienia badań nad lekami (29). Intensywna toksyczność in vivo oraz profile farmakokinetyczne składników w bibliotece pozwalają na szybki dalszy rozwój tych związków. Kilka związków z JHDL zostało ulepszonych w badaniach klinicznych nad rakiem i innymi zastosowaniami terapeutycznymi (13,14,16,17,30–32).

w niniejszym badaniu zbadaliśmy skład JHDL, które w różny sposób hamują wzrost komórek nowotworowych w obecności hamowania CDK5; tiloron i analog tiloronu zidentyfikowano jako środki selektywnie ukierunkowane na komórki nowotworowe Pc3prostatu z niedoborem CDK5. Tiloron (Amixin IC) jest stosowany klinicznie w niektórych krajach jako doustnie aktywny środek przeciwwirusowy (25). Tiloron został przetestowany u ludzi w leczeniu glejaków mózgu, brodawczaka krtani i raka piersi (28,33,34).Chociaż zgłaszano skuteczność przeciwnowotworową, zainteresowanie leczeniem tilorone forcancer zmniejszyło się. Niedawno zhou i wsp. donieślinowe analogi tiloronu o ulepszonej aktywności przeciwnowotworowej (35). Analogi te mogą być obiecujące dla toksaminy, szczególnie w połączeniu z hamowaniem CDK5.

oprócz możliwości, że tiloron może być promowany w połączeniu z hamowaniem CDK5, identyfikacja tiloronu jako środka, który selektywnie atakuje komórki z aktywnym CDK5 sugeruje potencjalne klasy leków zwiększające skuteczność hamowania CDK5. Tiloron został scharakteryzowany jako induktor aninterferonu (24). Wskazuje to, że sam interferon lub alternatywny interferoninducer, taki jak agonista TLR, może być przydatny w połączeniu z inhibitorem aCDK5. Niemniej jednak mogą być zaangażowane inne mechanizmy. Na przykład tiloron jest również czynnikiem interkalującym DNA (24) i można sobie wyobrazić, że może modulować strukturę chromatyny i ekspresję genów. Inne funkcje tiloronu, w tym szlak sygnałowy i czynnik transkrypcyjny (36,37), mogą być również zaangażowane. Potrzebne są dalsze badania, aby rozwikłać dokładny mechanizm działania, dzięki któremu tiloron selektywnie celuje w komórki raka prostaty z ujemnym wynikiem CDK5.

podziękowania

autorzy pragną podziękować Profesorom P. J. Van Diestand E. Van der Wall za ich wsparcie i dyskusję oraz profesurę.A. Carducci i J. T. Isaacs za dostarczanie materiałów laboratoryjnych. Badanie to było wspierane przez flight Attendant MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, dod grantW81XWH-06-1-0139 i NCI sport grant P50 CA58236. M. D. W. był wspierany przez program Dr Saal van Zwanenbergstichting i HuygensScholarship.