suplementy witaminy D i kwasów tłuszczowych omega-3 u dzieci z zaburzeniami ze spektrum autyzmu: protokół badania w randomizowanym, podwójnie ślepym, kontrolowanym placebo badaniu czynnikowym

badanie to składa się z dwóch etapów: Etap 1 obejmuje rekrutację i badania przesiewowe, podczas gdy etap 2 to randomizowane, podwójnie ślepe, placebo LCPUFA z witaminą D i n-3-badanie kontrolowane (rys. 1). Czas trwania interwencji wynosi 12 miesięcy.

schematyczny schemat projektowania badań. 1 biomarkery krwi: 25-hydroksywitamina D (25(OH)D), czerwone krwinki (RBC) kwasy tłuszczowe, wapń, albumina, badania żelaza, witamina B12, kwas foliowy, pełna morfologia krwi i witamina A. kwestionariusze: socjodemografia, historia medyczna, zachowania związane z jedzeniem/posiłkami i dziennik żywności. 2 pytania: funkcjonowanie socjokomunikacyjne, problemy sensoryczne i nieprawidłowe zachowania (podstawowe wyniki); objawy żołądkowo-jelitowe (wtórne), ekspozycja na słońce i kolor skóry. Antropometria: waga i wzrost. Biomarkery 3Blood: 25 (OH)d, kwasy tłuszczowe RBC, wapń i albuminy. Kwestionariusze: funkcjonowanie socjokomunikacyjne, problemy sensoryczne, nieprawidłowe zachowania (podstawowe wyniki) oraz zachowania związane z jedzeniem/posiłkami i jakością diety. Antropometria: waga i wzrost. Biomarkery krwi: 25 (OH)D, wapń i albumina. * Objawy żołądkowo-jelitowe (wtórny wynik) i stosowanie leków / suplementów / częstość występowania zdarzeń niepożądanych / zgodność z suplementami będą monitorowane przez cały okres badania

Etap 1 zapewni możliwość kompleksowego opisu badanej populacji w odniesieniu do stanu odżywienia (wskaźniki biochemiczne i spożycie), demografii i historii medycznej. Etap 2 zademonstruje skuteczność suplementacji witaminą D, N-3 LCPUFAs lub obu w zmniejszaniu objawów ASD.

uczestnicy

to badanie jest wynikiem współpracy pomiędzy Uniwersytetem Massey I Waitemata District Health Board (WDHB), Nowa Zelandia. Do opiekunów dzieci spełniających kryteria badania zwracają się w pierwszej kolejności koordynatorzy rozwoju WDHB.

obliczyliśmy, że 42 uczestników (minimum 34 uczestników i dopuszczający 20-% potencjalny wskaźnik porzucania nauki) będzie wymagane dla każdego ramienia badania, aby wykazać klinicznie istotną różnicę przy 80% mocy i 5% istotności statystycznej. Obliczenia mocy opierały się na 17-jednostkowej różnicy między grupami uzupełnionymi a placebo w zmianie od punktu początkowego do punktu końcowego w skali odpowiedzi Społecznej (SRS), na średnim SRS i odchyleniu standardowym wynoszącym odpowiednio 105 i 24,7 jednostek u nieleczonych dzieci z ASD (z naszego badania pilotażowego z 2015 r., niepublikowanego). Wielkość próby obliczono według poniższego wzoru:

gdzie N to wielkość próbki wymagana na Grupę, α to SD, K to stała (7.9 oznacza 80% mocy i 5% znaczenia), a (μ2-μ1)jest różnicą całkowitego wyniku SRS między grupami.

aby upewnić się, że badanie jest odpowiednio napędzane, ślepa analiza okresowa przy > 50% wstępnie planowanego włączenia zostanie przeprowadzona przez niezależną stronę trzecią w celu oszacowania wariancji potencjalnego wzrostu wielkości próby.

kryteria włączenia i wykluczenia

dzieci kwalifikują się do tego badania, jeśli są w wieku od 2 lat.5 i 8 lat, mają diagnozę medyczną ASD potwierdzoną zarówno przez pediatrę rozwojowego, zgodnie z kryteriami wymienionymi w diagnostycznym i statystycznym podręczniku zaburzeń psychicznych , wersja piąta (DSM-5), jak i początek objawów po 18 miesiącu życia. Dolna granica 2,5 roku została wybrana na podstawie kryteriów wiekowych narzędzi oceny psychologicznej, a górna granica 8 lat została wybrana, aby uniknąć mylącego efektu zmian behawioralnych związanych ze stadium dojrzewania. Wymagana jest znajomość języka angielskiego przez opiekuna (ze względu na charakter narzędzi oceny wyników). Wolontariusze są wykluczeni, jeśli zdiagnozowano u nich opóźnienie rozwoju od urodzenia.

dodatkowymi kryteriami włączenia do badania są: czynność wątroby w zakresie prawidłowym (albumina 34-48 g/l)i surowicy 25(OH) d <75 + 10 nmol/l, jeśli biorą udział w badaniu zimą i <105 nmol/l + 10 nmol / l, jeśli biorą udział w badaniu latem. Zmienność 10-nmol/L wybrano ze względu na potencjalną zmienność testu . Zastosowaliśmy dwa różne punkty odcięcia dla wykluczenia, ponieważ w Nowej Zelandii występuje duże sezonowe zróżnicowanie stężenia 25(OH)D w surowicy w zakresie od 30 nmol/L do 44 nmol/l .

Próbki krwi nie na czczo będą pobierane w szpitalach North Shore lub Waitakere w Auckland w Nowej Zelandii. Kwestionariusze i antropometria będą prowadzone na Uniwersytecie Massey w Auckland w Nowej Zelandii. Auckland jest największym miastem Nowej Zelandii z populacją nieco ponad miliona. Szacuje się, że około 13 000 (32,5 %) osób z ASD mieszka w regionie Greater Auckland .

Etap 1 – screening

Screening i Rekrutacja (Etap 1 badania) będą miały miejsce w okresie 24 miesięcy, który rozpoczął się w styczniu 2015 roku. Dzieci, które spełniają kryteria wstępnego włączenia, będą miały pobranie krwi i zostaną przebadane pod kątem niedoborów żywieniowych. Patrz tabele 1 i 2, aby uzyskać wyniki, metody testowania i harmonogram rekrutacji, interwencji i oceny, odpowiednio.

preparat przed interwencją

przed randomizacją i włączeniem do badania niedobory witaminy D, żelaza i witaminy B12 zostaną usunięte. Lista niedoborów żywieniowych i strategii zarządzania zastosowanych w tym badaniu znajduje się w tabeli 3.

Etap 2-interwencja witaminy D I n-3 lcpufa

interwencja składa się z 2000 IU witaminy D3 dziennie, 722 mg DHA dziennie, 2000 IU witaminy D3 plus 722 mg DHA dziennie lub placebo, w postaci czterech kapsułek doustnych. Materiały lecznicze będą dostarczane w kapsułkach żelowych 750 mg z odrywaną dyszą wyprodukowaną i dostarczoną przez Douglas Nutrition Ltd., Auckland, Nowa Zelandia. Badane kapsułki, Witamina D, N-3 LCPUFAs i placebo mają identyczny wygląd, a wszystkie są bez smaku i bezbarwne. Dziecko musi spożywać zawartość czterech kapsułek dziennie zmieszanych z preferowanym pokarmem lub doustnie za pomocą strzykawki. Całkowite dzienne spożycie i zawartość każdej kapsułki podano w tabeli 4. Przez cały okres badania dzieci mogą mieć jakąkolwiek terapię lub leki na autyzm, a także wszelkie suplementy, pod warunkiem, że nie zawierają witaminy D ani omega-3.

wykazano , że suplementacja 2000 IU witaminy D3 jest bezpieczną dawką u niemowląt, a Francuskie Towarzystwo Pediatryczne zaleca 1000 do 1200 IU dziennie u niemowląt karmionych piersią . Masa ciała 2,5-8-latków w naszym badaniu będzie znacznie większa niż u niemowląt, co powinno dodatkowo zmniejszyć ryzyko wystąpienia działań niepożądanych. Ponadto, 2000 j. m .na dobę jest mniejsza niż bezpieczna górna granica 2500 i 3000 J. M. na dobę sugerowana przez IOM odpowiednio dla grup wiekowych 1-3 i 4-8 lat.

dawka DHA wynosząca 722 mg / dobę jest fizjologicznie istotna i osiągalna poprzez dietę (odpowiada około trzem porcjom tłustych ryb tygodniowo) i jest porównywalna z dawkami stosowanymi w innych badaniach u dzieci oceniających wpływ LCPUFAs n-3 na zachowanie i uczenie się . Nie zgłaszano żadnych działań niepożądanych u dzieci otrzymujących dawkę 600 mg DHA / dobę .

randomizacja, oślepianie i ukryty przydział

dzieci zostaną losowo przydzielone do jednej z czterech grup, po stratyfikacji ze względu na wiek i nasilenie ASD. Randomizacja kapsułek aktywnych / placebo, lista randomizowanych sekwencji i przypisanie do grupy będą całkowicie ukryte przed naukowcami, dziećmi i opiekunami przez cały okres badania, w tym analizę danych. Osoba trzecia nie zaangażowana w żadne aspekty badania wygeneruje losowy Projekt bloku w blokach czterech i ośmiu za pomocą Randomization.com (http://www.randomization.com/) Osoba trzecia przydzieli dziecku kod leczenia po potwierdzeniu kwalifikacji do interwencji i uzyskaniu zgody opiekuna. W sytuacji awaryjnej, w której konieczne będzie przerwanie badania w ciemno, zostaną wprowadzone plany, aby główny badacz skontaktował się z osobą trzecią odpowiedzialną za randomizację w celu ujawnienia przydziału leczenia dla danego uczestnika.

zbieranie danych

uczestnicy (opiekunowie i dzieci) będą uczestniczyć w Human Nutrition Research Unit (HNRU) na Uniwersytecie Massey dwukrotnie: w fazie początkowej i 12 miesięcy. Po rekrutacji do etapu 2 i przed otrzymaniem 4-miesięcznej dostawy suplementów, opiekunowie wypełnią kilka kwestionariuszy na temat podstawowych objawów ASD (funkcjonowanie socjokomunikacyjne i problemy sensoryczne) i zachowań odbiegających od normy jako podstawowe miary wyników badania, a na objawy żołądkowo-jelitowe jako drugorzędowy miara wyników. Po zakończeniu interwencji (12 miesięcy) powtórzy się ocena podstawowych objawów ASD i nieprawidłowych zachowań dokonywana przez opiekunów. Opiekunowie będą również wypełniać tygodniowe dzienniki objawów żołądkowo-jelitowych w okresie badania.

dodatkowe informacje zostaną zebrane w celu opisania charakterystyki badanej populacji na początku badania. Informacje te obejmują zachowania związane z jedzeniem / posiłkami, dzienniki żywności, ekspozycję na słońce, kolor skóry i antropometrię (waga i wzrost). Podczas ostatniej wizyty powtórzona zostanie podstawowa ocena zachowań żywieniowych/pokarmowych oraz zostanie zmierzona waga/wzrost dzieci. Patrz Tabela 1, Aby uzyskać wyniki i metody testowania.

pobieranie i analiza krwi

próbki krwi u dzieci będą pobierane trzykrotnie, w fazie początkowej (Etap 1-badanie przesiewowe), 6 miesięcy (środki bezpieczeństwa) i 12 miesięcy (punkt końcowy). Patrz Tabela 1 dotycząca biomarkerów żywieniowych i metod testowania. Próbki krwi nie na czczo będą pobierane pod nadzorem personelu pediatrycznego i przetwarzane w szpitalach North Shore lub Waitakere WDHB laboratory service. Biomarkery odżywcze zostaną zbadane z próbki krwi żylnej. Należą do nich następujące: 25 (OH) d, kwasy tłuszczowe RBC, wapń, albumina, badania żelaza, witamina B12 i kwas foliowy, morfologia krwi i witamina A. z wyjątkiem kwasów tłuszczowych RBC i witaminy a, wszystkie biomarkery będą analizowane w szpitalu North Shore. Kwasy tłuszczowe RBC będą analizowane na Uniwersytecie w Wollongong, NSW, Australia, A witamina A w laboratorium na Uniwersytecie Massey, Auckland, Nowa Zelandia.

kwestionariusze

podstawowym kryterium oceny wyników są psychologiczne oceny podstawowych objawów ASD i współistniejących zachowań problemowych, które przedstawiono szczegółowo w tabeli 1. Wtórną miarą wyników jest ocena problemów żołądkowo-jelitowych. Wszystkie Opiekunki otrzymają znormalizowane instrukcje dotyczące wypełniania kwestionariuszy podczas wizyty w HNRU. Przed wyjazdem uczestnika badacze HNRU sprawdzają wszystkie odpowiedzi pod kątem kompletności.

Skala reakcji społecznej™, Wydanie drugie (SRS-2) : zostaną wykorzystane wersje SRS-2 specyficzne dla grup wiekowych 2,5–4,5 i 4,5 do 18 lat. SRS-2 identyfikuje upośledzenie społeczne związane z ASD i określa jego dotkliwość w dziedzinach świadomości społecznej, przetwarzania informacji społecznych, wzajemnej komunikacji społecznej, lęku społecznego/unikania oraz stereotypowych zachowań/ograniczonych interesów . Ważność kliniczna i czułość SRS-2 określono w populacjach z ASD .

sensoryczne środki przetwarzania™ (SPM) : zostaną wykorzystane wersje SPM specyficzne dla grup wiekowych 2-5 i 5-12 lat. SPM ocenia przetwarzanie sensoryczne, planowanie i idee (praxis) oraz udział społeczny u dzieci. Skale mierzą udział społeczny, wzrok, słuch, dotyk, świadomość ciała (propriocepcja), równowagę i ruch (funkcja przedsionkowa) oraz planowanie i idee (praxis) . Narzędzie to zostało znormalizowane, zatwierdzone i stosowane u dzieci z ASD .

Aberrant Behaviour Checklist (ABC): ABC mierzy różne problemy z zachowaniem, a mianowicie drażliwość, wycofanie społeczne, stereotypowe zachowanie, nadpobudliwość i niewłaściwą mowę . Został on zwalidowany u dzieci z ASD i był szeroko stosowany w badaniach wyników leczenia ASD .

kwestionariusz objawów żołądkowo-jelitowych: kwestionariusz objawów żołądkowo-jelitowych został zaprojektowany specjalnie do tego badania i obejmuje objawy przedmiotowe i podmiotowe dotyczące przewodu pokarmowego najczęściej zgłaszane u dzieci z ASD . Opiekunowie uczestników badania otrzymają cotygodniowe dzienniki online i zostaną poproszeni o odnotowanie, czy dziecko miało zaparcia, biegunkę, wzdęcia, ból brzucha, wymioty/nudności, wzdęcia brzucha, niewyjaśnioną drażliwość w ciągu dnia lub/i niewyjaśnione nocne przebudzenie w ciągu ostatniego tygodnia, a jeśli tak, to ile razy to się zdarzyło. Kwestionariusz objawów żołądkowo-jelitowych nie został zwalidowany, ale zawiera pytania dotyczące objawów żołądkowo-jelitowych najczęściej zgłaszanych w populacjach ASD lub zachowań, które mogą być konsekwencją objawów żołądkowo-jelitowych. Nie znamy zatwierdzonego instrumentu do oceny objawów żołądkowo-jelitowych u dzieci autystycznych, a już na pewno nie w Nowej Zelandii.

dietetyczny indeks żywienia dzieci (kostka): DICE to proste narzędzie do oceny jakości diety, które zostało opracowane przez zespół badawczy w oparciu o wytyczne nowozelandzkiego Ministerstwa zdrowej żywności i Żywienia dla zdrowych dzieci i młodzieży . Narzędzie to zostało zatwierdzone w kohorcie zdrowych dzieci z Nowej Zelandii w wieku od 2 do 8 lat (niepublikowane) i zostanie zatwierdzone u dzieci z ASD w tym badaniu na podstawie 4-dniowego szacunkowego dziennika żywności i markerów biochemicznych.

Pediatria behawioralna skala oceny żywienia (BPFAS): BPFAS to proste narzędzie oceny, które mierzy zachowanie dziecka w czasie posiłku oraz postawy i zachowania rodziców. Jest to kwestionariusz w skali 35 elementów składający się z pytań w skali 25 Likerta (5 punktów) dotyczących zachowań dzieci oraz 10 pytań dychotomicznych dotyczących postaw i zachowań rodziców. Ostatnio ustalono wyniki graniczne dla BPFA . BPFAS jest najbardziej wiarygodnym kwestionariuszem żywienia podawanym rodzicom, o dobrej wewnętrznej ważności i niezawodności testu.

czterodniowy dzienniczek: dane dotyczące spożycia będą zbierane przez 4-dniowy szacowany dziennik żywności, w tym jeden dzień weekendowy. Instrukcje dotyczące dokładnego wypełniania dziennika żywności będą dostarczane wraz z dziennikiem żywności. Uczestnicy otrzymają bezpłatną, wstępnie zaadresowaną kopertę na zwrot broszury. Średnie spożycie makro i mikroelementów będzie oceniane w ciągu czterech zgłoszonych dni za pomocą FoodWorks Professional Edition 7 (Xryis Software, Brisbane, QLD, Australia, 2012).

w niniejszym badaniu wybrano 4-dniowy dziennik żywności ze względu na duże obciążenie respondenta i czasochłonność dłuższych dzienników żywności, takich jak 7-dniowy dziennik żywności. Ze względu na dużą zmienność spożycia składników odżywczych w obrębie osoby, zaleca się rejestrowanie spożycia w dłuższym okresie czasu, aby uzyskać bardzo dokładne oszacowanie spożycia. Jeśli jednak 4-dniowy dziennik żywności obejmuje losowo różne dni, może dostarczyć dokładnych szacunków spożycia.

informacje dotyczące ekspozycji na słońce i koloru skóry, suplementów diety i wszelkich specjalnych schematów diety będą zbierane przez kwestionariusze specjalnie zaprojektowane do celów obecnego badania. Kwestionariusz ekspozycji na słońce zawiera pytania dotyczące przekonań i postaw opiekuna wobec ekspozycji na słońce, a także pytania dotyczące kraju i miasta zamieszkania w ciąży, pory porodu i wrażliwości dziecka na ekstremalne temperatury i światła.

zgodność z lekami/przestrzeganie protokołu badania

opiekunowie otrzymają cotygodniowe wiadomości e-mail zawierające link do internetowego dziennika zgodności i problemów żołądkowo-jelitowych oraz wskazówkę / fakt na temat autyzmu i kwestii żywieniowych. Opiekunowie zostaną powiadomieni telefonicznie o 1, 3, 6 i 9 miesiącu w celu zachowania morale i zachęcenia do przestrzegania przepisów. Opiekunowie otrzymają również kwartalne biuletyny próbne. Biuletyny będą zawierały aktualizację badania, ogólne tematy dotyczące ASD, doświadczenie opiekuna w odniesieniu do tego tematu oraz rozrywki / konkursy dla badanych dzieci.

nowe materiały interwencyjne będą wysyłane do uczestników co 4 miesiące, a opiekunowie zostaną poproszeni o umieszczenie butelek z poprzednich miesięcy z niewykorzystanymi kapsułkami, które zostaną zwrócone podczas następnej wizyty (6 lub 12 miesięcy), na którym etap niewykorzystane kapsułki będą liczone i rejestrowane. Zgodność z leczeniem będzie analizowana poprzez liczenie pozostałych suplementów każdego uczestnika po zakończeniu interwencji.

działania niepożądane

wszyscy uczestnicy zostaną wezwani po 6 miesiącach do wykonania badania krwi w celu sprawdzenia, czy nie występują hiperwitaminoza D (w surowicy 25 (OH) d >225 nmol/l) i hiperkalcemia (w surowicy Ca >2, 7 mmol / l). Wyniki będą sprawdzane przez osobę trzecią, która nie jest ślepa (ale nie bierze udziału w analizie wyników). Osoba trzecia będzie de-identyfikacji wyników badań krwi i wysłać je do badania pediatry i starszego badacza do przeglądu i zalecenia, jeśli w surowicy dziecka 25 (OH) D lub poziom wapnia jest powyżej bezpiecznej górnej granicy. Jeśli stężenie 25 (OH)D osiągnie lub zbliży się do 225 nmol/L lub występuje hiperkalcemia, dawka zostanie dostosowana.

dzienniki zgodności i objawów żołądkowo-jelitowych będą monitorowane co tydzień, a wszystkie działania niepożądane będą rejestrowane w dzienniku zdarzeń niepożądanych, aby śledzić ogólny stan zdrowia i reakcje behawioralne dziecka. W przypadku wystąpienia jakichkolwiek działań niepożądanych zdrowie dziecka będzie monitorowane dokładniej przez trzy do czterech kolejnych tygodni, a jeśli zdarzenie niepożądane będzie się utrzymywać, zgłoszenia zostaną przekazane badanemu pediatrze i starszemu badaczowi w celu dalszego zbadania.

rozpowszechnianie wyników

po otrzymaniu i analizie dziennika żywności oraz zakończeniu testów biochemicznych podczas badań przesiewowych, każdy uczestnik otrzyma formularz informacji zwrotnej. Zostaną również uwzględnione pomiary antropometryczne i wyniki krwi (badania żelaza, witaminy B12, kwasu foliowego i pełnej morfologii krwi). Po zakończeniu rekrutacji do badania uczestnicy, którzy nie przystąpili do badania, otrzymają powiadomienie o poziomie witaminy D i kwasów tłuszczowych RBC.

po zakończeniu badania uczestnicy zostaną poinformowani o wyjściowym i końcowym statusie witaminy D i kwasu tłuszczowego we krwi oraz o tym, czy przyjmowali dawkę czynną, czy placebo. Otrzymają również podsumowanie wyników oceny psychologicznej SRS-2 i SPM.

uczestnicy i inne zainteresowane strony (takie jak pracownicy służby zdrowia, Okręgowe Rady ds. Zdrowia, Organizacje podstawowej opieki zdrowotnej, grupy wsparcia ASD) otrzymają dostęp do wyników badania. Wyniki będą prezentowane na konferencjach naukowych w kraju i za granicą, przygotowywane do publikacji w recenzowanych czasopismach i rozpowszechniane w mediach.

przetwarzanie danych i analiza statystyczna

Nazwa i dane adresowe będą przechowywane w programie Microsoft Excel. Pola wyboru będą rejestrować postępy uczestnika w badaniu. Wszystkie pozostałe dane zostaną wprowadzone do jednego arkusza kalkulacyjnego programu Microsoft Excel, a uczestnicy zostaną zidentyfikowani wyłącznie za pomocą unikalnego numeru przedmiotu. Wyniki kwestionariuszy będą dwukrotnie sprawdzane przez psychologa i badacza. Wszystkie zgłoszenia będą dwukrotnie sprawdzane przez innego członka zespołu badawczego. Wszystkie dokumenty będą bezpiecznie przechowywane w poufnych warunkach i archiwizowane przez 5 lat.

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu IBM SPSS w wersji 21.0 (IBM Corp; Wydany 2012. IBM SPSS Statistics dla systemu Windows w wersji 21.0. Armonk, NY, USA). Przed rozpoczęciem analizy statystycznej dane są czyszczone i sprawdzane pod kątem błędów kodowania. Dane będą sprawdzane pod kątem wiarygodności, losowo sprawdzając dokładność i kompletność oraz weryfikując dane źródłowe. Zmienne będą testowane pod kątem normalności za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, testu Shapiro-Wilka i wykresów normalności. Nie – normalnie rozproszone dane zostaną przekształcone w przybliżone rozkłady normalne za pomocą przekształceń logarytmicznych. Dane będą przekazywane odpowiednio jako średnia (odchylenie standardowe) dla danych normalnie rozproszonych; przekształcone dane zostaną przekształcone wstecz ze statystyk sumarycznych w średnią geometryczną (95% CI), dane o nieregulowanym rozkładzie zostaną opisane jako mediana (25., 75. percentyl), a dane kategoryczne jako częstotliwości.

charakterystyka wyjściowa uczestników zostanie porównana między grupami wykorzystującymi analizę wariancji (ANOVA) dla danych parametrycznych i test Kruskala-Wallisa dla danych nieparametrycznych. Pierwotna analiza, porównująca wpływ leczenia na objawy autyzmu w okresie 12 miesięcy, zostanie przeprowadzona przy użyciu uogólnionej liniowej procedury mieszanej. Zabiegi i czas zostaną uwzględnione jako stałe efekty, a interakcje między interwencjami i czasem zostaną przetestowane. W przypadku zaobserwowania istotnych efektów głównych lub interakcji, zostanie przeprowadzona analiza post-hoc z zastosowaniem modyfikacji Bonferroni. Potencjalne czynniki zakłócające i modyfikatory efektów(np. wyjściowe kwasy tłuszczowe 25 (OH)D i RBC, objawy autyzmu w punkcie wyjściowym, wiek i płeć) zostaną zbadane w ramach modelu. Regresja logistyczna zostanie wykorzystana do przetestowania interakcji multiplikatywnej. Wskaźnik synergii rothmana, który byłby równy jedności przy addytywności i mniejszy niż jedność przy sugerowaniu antagonizmu, zostanie wykorzystany do zbadania postulowanego wpływu interakcji witaminy D i omega-3 LCPUFAs na podstawowe objawy ASD.

analiza wtórna, porównująca wpływ leczenia na objawy żołądkowo-jelitowe w ciągu 12 miesięcy, zostanie przeprowadzona przy użyciu tej samej procedury. Potencjalne czynniki zakłócające i modyfikatory efektów (np. wyjściowa diagnoza wszelkich objawów żołądkowo-jelitowych i stosowanie leków/suplementów) zostaną zbadane w ramach modelu.

różnice między uczestnikami, którzy ukończą i wycofają się z badania, będą analizowane przy użyciu niezależnego testu T lub testu Manna–Whitneya dla zmiennych ciągłych (np. wiek) i chi-kwadrat dla zmiennych kategorycznych (np. płeć).

powiązania między nasileniem objawów ASD a stanem odżywienia (w szczególności witamina D, kwasy tłuszczowe RBC, żelazo i witamina B12) na początku będą oceniane za pomocą analizy regresji. Informacje te zostaną wykorzystane do oceny odpowiedzi na leczenie w zależności od tertyli o stanie odżywczym wykazujących znaczący związek z nasileniem ASD.

zostaną wykorzystane zarówno analizy intention-to-treat, jak i per-protocol, chociaż podstawową metodą analizy będzie intention-to-treat. Istotność statystyczna będzie oparta na testach dwuogonowych z P <0,05 uznanymi za znaczące.