test TUNELA jest najczęściej stosowany do wykrywania komórek poddawanych apoptozie, która jest formą programowanej śmierci komórki. Apoptoza jest ważnym procesem biologicznym podczas rozwoju i utrzymania homeostazy tkanek. Barwienie tunelowe pozwala na wizualizację i kwantyfikację komórek apoptotycznych. Pomaga to naukowcom przetestować skuteczność nowych metod leczenia zaburzeń, w których apoptoza jest hamowana, jak w przypadku raka, lub wzmocniona, jak w neurodegeneracji.
ten film wyjaśni, w jaki sposób test TUNELA można wykorzystać do oznaczania komórek poddawanych apoptozie, protokołu krok po kroku do wykonywania tej metody w sekcjach tkanek, oraz w jaki sposób naukowcy stosują tę technikę do zrozumienia mechanizmów śmierci komórki.
zanim zagłębimy się w protokół testu TUNELA, omówmy Zasady stojące za tą techniką.
jedną z wielu cech charakterystycznych apoptozy jest fragmentacja DNA. Jak dochodzi do fragmentacji DNA? Apoptozę przeprowadzają enzymy zwane kaspazami obecne w cytozolu. Ich główną rolą jest rozszczepianie białek w celu demontażu komórki. Ponadto kaspazy aktywują enzym zwany dnazą aktywowaną kaspazą lub CAD, odłączając go od swojego inhibitora—ICAD. Aktywowany CAD jest endonukleazą, która podróżuje do jądra i rozszczepia chromosomalne DNA.
rozszczepienie DNA ostatecznie powoduje nagromadzenie fragmentów DNA z naciętymi końcami, a test TUNELA fluorescencyjnie etykietuje te nacięte końce fragmentowanego DNA, umożliwiając naukowcom wykrycie apoptozy. Ale jak to się dzieje? W tym celu musisz zrozumieć reakcję TUNELA. TUNEL to skrót od terminalu deoksynukleotydylotransferazy, w którym pośredniczy dUTP-end. Dwa główne odczynniki tunelowe to końcowa deoksynukleotydylotransferaza lub TDT i trifosforan deoksyurydyny lub dUTP, które mogą być fluorescencyjnie znakowane dla ułatwienia wykrywania.
aby zrozumieć reakcję TUNELA, wróćmy do komórek apoptotycznych z fragmentami DNA. Fragmenty te mają wolne 3 ’ grupy hydroksylowe. Po dodaniu odczynników tunelowych do próbki zawierającej komórki apoptotyczne, fluorescencyjnie znakowane dutp przyłączają się do tych 3 ’ grup hydroksylowych za pomocą katalizatora enzymu TDT. Komórki barwione za pomocą tej procedury nazywane są tunelowymi komórkami dodatnimi, które można następnie wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
teraz, gdy rozumiesz podstawowe zasady i koncepcje testu TUNELA, zarysujmy ogólny protokół wykonywania tej techniki w sekcjach tkanek. Główne etapy testu TUNELA obejmują ustalenie interesującej tkanki, permeabilizację tkanki, dodanie odczynników tunelowych, zatrzymanie reakcji TUNELA i wreszcie analizę.
po pierwsze, interesująca tkanka musi być ustalona w celu zachowania struktur biologicznych. Fiksacja działa poprzez sieciowanie białek w komórkach. W przypadku testu tunelowego tkanki można utrwalić przez dodanie ich do roztworu zawierającego 4% paraformaldehydu przez 4-24 godziny w temperaturze 4°C. po utrwaleniu kriosekcja tkanki w cienkie plasterki o grubości 10 µm lub mniejszej.
kolejnym etapem jest permeabilizacja, która pozwala odczynnikom takim jak enzym TdT przeniknąć do jądra komórkowego. Permeabilizację sekcji tkankowych można przeprowadzić przez dodanie tkanki do roztworu proteinazy K przez 5-15 minut w temperaturze 37°C. przepłukać sekcje tkanek roztworem buforowanym fosforanem soli fizjologicznej na wytrząsarce orbitalnej przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej.
po permeabilizacji enzym TDT i fluorescencyjnie znakowane dutp są dodawane do sekcji tkankowych, wraz z buforem etykietującym zawierającym kobalt, który działa jako kofaktor dla reakcji TUNELA. Razem mieszaninę reakcyjną TUNELA i sekcję tkankową inkubuje się przez 1-3 godziny w temperaturze 37°C i chroni przed światłem, aby zapobiec blaknięciu fluorescencji.
po inkubacji do sekcji tkankowej dodaje się bufor stop w celu przerwania reakcji TUNELA, a po krótkiej inkubacji odcinki przemywa się buforowaną fosforanem solą fizjologiczną. Na koniec, sekcje tkanki barwione za pomocą fluorescencyjnie oznakowanego dUTP są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i oceniane pod kątem lokalizacji tunelowych komórek dodatnich w danej tkance. Można określić ilościowo śmierć komórki po prostu licząc procent tunelowych komórek dodatnich w danym odcinku tkanki.
teraz, gdy widziałeś, jak wykonać test TUNELA w celu wykrycia komórek apoptotycznych, omówmy, w jaki sposób ten test może być użyty do odpowiedzi na pytania zadawane przez biologów komórkowych.
śmierć komórki występuje jako normalna część rozwoju do rzeźbienia tkanek i struktur oraz do eliminacji niepotrzebnych komórek. Dlatego naukowcy zainteresowani tym zjawiskiem badają wpływ prenatalnej ekspozycji na różne substancje na apoptozę podczas rozwoju. Tutaj naukowcy byli zainteresowani zbadaniem wpływu prenatalnej ekspozycji na alkohol na rozwój mózgu. Wyniki barwienia tunelowego na mózgach płodu wykazały zwiększoną apoptozę w tkankach, które były prenatalnie narażone na działanie alkoholu, w porównaniu do zwierząt kontrolnych.
naukowcy wykorzystują również test TUNELA do badania apoptozy w odpowiedzi na infekcję bakteryjną. W tym eksperymencie naukowcy opracowali model zapalenia płuc poprzez wstrzyknięcie myszom Pseudomonas aeruginosa, który indukuje zapalenie płuc. Następnie usunięto tkankę płucną i przeprowadzono barwienie TUNELA w celu zbadania apoptozy w odpowiedzi na infekcję bakteryjną. Wyniki pokazują, że apoptotyczna śmierć komórek wzrosła u myszy narażonych na działanie bakterii, w porównaniu do zwierząt kontrolnych.
wreszcie, barwienie tunelowe może być stosowane na próbkach ludzkiego guza, w celu określenia reakcji guza na leki. W tym przykładzie próbki guza pobierano od pacjentów i hodowano ex vivo. Następnie leczono je lekami przedklinicznymi i oceniano pod kątem odpowiedzi za pomocą testu TUNELA. Uzyskane dane pokazują, że leczenie lekiem hamującym białko szoku cieplnego 90 znacznie zwiększa apoptozę w tkance nowotworowej.
właśnie obejrzałeś film JoVE ’ a o użyciu testu TUNELA do wykrywania komórek poddawanych apoptozie. W tym filmie omówiono zasady barwienia tunelowego i protokół krok po kroku do wykonania testu tunelowego na sekcjach tkanek. Sprawdziliśmy również, jak tę metodę można zastosować do zrozumienia programowanej śmierci komórki podczas rozwoju i choroby. Jak zawsze, dzięki za oglądanie!
