oczyszczanie Białkaedytuj
znaczniki Polihystydyny są często używane do oczyszczania powinowactwa oznaczonych polihystydyną rekombinowanych białek ekspresji w Escherichia coli i innych prokariotycznych systemach ekspresji. Komórki bakteryjne są zbierane poprzez odwirowanie, a otrzymany osad komórkowy jest lizowany za pomocą środków fizycznych lub za pomocą detergentów i enzymów, takich jak lizozym lub dowolna ich kombinacja. Na tym etapie surowy lizat zawiera rekombinowane białko wśród wielu innych białek pochodzących od gospodarza bakteryjnego. Mieszanina ta jest inkubowana z żywicą powinowactwa zawierającą wiązane dwuwartościowe jony niklu lub kobaltu, które są dostępne w handlu w różnych odmianach. Nikiel i kobalt mają podobne właściwości i są sąsiadującymi metalami przejściowymi okresu 4 (v. Triada żelaza). Żywice te są na ogół sepharose / agaroza funkcjonalizowane z chelatorem, takie jak kwas iminodioctowy (Ni-IDA) i kwas nitrylotrioctowy (Ni-Nta) dla niklu i karboksylo-metylo asparaginian (Co-CMA) dla kobaltu, które znacznik polihistydyny wiąże z mikromolowym powinowactwem. Ernst Hochuli et al. w 1987 r. połączono ligand NTA i jony niklu z kulkami agarozowymi. Następnie żywicę przemywa się buforem fosforanowym w celu usunięcia białek, które nie oddziałują specyficznie z jonami kobaltu lub niklu. Dzięki metodom opartym na Ni skuteczność mycia można poprawić przez dodanie 20 mM imidazolu(białka są zwykle eluowane imidazolem 150-300 mM). Ogólnie rzecz biorąc, żywice na bazie niklu mają wyższą zdolność wiązania, podczas gdy żywice na bazie kobaltu oferują najwyższą czystość. Czystość i ilość białka można ocenić za pomocą SDS-PAGE i Western blotting.
oczyszczanie powinowactwa przy użyciu znacznika polihystydyny zwykle skutkuje stosunkowo czystym białkiem, gdy rekombinowane białko ulega ekspresji w organizmach prokariotycznych. W zależności od dalszych zastosowań, w tym oczyszczania kompleksów białkowych w celu badania interakcji z białkami, oczyszczanie z organizmów wyższych, takich jak drożdże lub inne eukarioty, może wymagać tandemowego oczyszczania z użyciem dwóch znaczników w celu uzyskania wyższej czystości. Alternatywnie, jednoetapowe oczyszczanie przy użyciu unieruchomionych jonów kobaltu, a nie jonów niklu, zwykle daje znaczny wzrost czystości i wymaga niższych stężeń imidazolu do elucji oznaczonego his białka.
oznaczanie Polihystydyny jest opcją z wyboru do oczyszczania rekombinowanych białek w Warunkach denaturacji, ponieważ jego sposób działania zależy tylko od pierwotnej struktury białek. Na przykład, nawet gdy rekombinowane białko ulegnie silnej ekspresji w E. coli wytwarza ciało inkluzywne i nie można go uzyskać jako rozpuszczalne białko, można go oczyszczać denaturacją mocznika lub chlorowodorku guanidyny. Ogólnie rzecz biorąc, dla tego rodzaju techniki, Wiązanie histydyny jest miareczkowane przy użyciu pH zamiast wiązania imidazolowego – przy wysokim pH, histydyna wiąże się z niklem lub kobaltem, ale przy niskim pH (~6 dla kobaltu i ~ 4 dla niklu), histydyna staje się protonowana i konkuruje z jonami metalu. Porównaj to z oczyszczaniem przeciwciał i oczyszczaniem GST, warunkiem wstępnym którego jest właściwe (natywne) składanie zaangażowanych białek. Z drugiej strony mówi się, że znacznik His ma tendencję do agregacji i nierozpuszczalności bardziej niż inne znaczniki powinowactwa.
kolumny znaczników Polihystydyny zachowują kilka dobrze znanych białek jako zanieczyszczenia. Jednym z nich jest izomeraza peptydylo-prolilowa typu fkbp, która pojawia się około 25kda (SlyD). Zanieczyszczenia są na ogół eliminowane przy użyciu wtórnej techniki chromatograficznej lub przez ekspresję rekombinowanego białka w szczepie E. coli z niedoborem SlyD. Alternatywnie, w porównaniu z żywicami na bazie niklu, żywice na bazie kobaltu mają mniejsze powinowactwo do SlyD z E. coli, ale w kilku przypadkach jest to umiarkowanie pomocne.
oddzielenie jednego od dwóch znaczników polihystydynyedytuj
białka o różnej liczbie znaczników polihystydyny eluują się inaczej niż żywica o powinowactwie niklowym. Dla białek z pojedynczym znacznikiem heksahistydynowym 75 mM imidazol umożliwia elucję z Ni-Nta, podczas gdy dla białek z dwoma znacznikami heksahistydynowymi do elucji wymagany jest 100 mM imidazol. Ten etapowy elucję można wykorzystać do wyizolowania specyficznych zespołów białkowych z mieszaniny, takich jak określone heteromultimery (np. heterodimer AB z mieszaniny zawierającej HOMODIMERY AA i BB, jeśli tylko podjednostka B ma znacznik polihystydyny). Takie podejście zastosowano w izolacji monowalentnej streptawidyny.
testy Wiązaniaedit
znakowanie Polihystydyny może być stosowane do wykrywania interakcji białko-białko w taki sam sposób jak test pull-down. Jednak ta technika jest ogólnie uważana za mniej wrażliwą, a także ograniczoną przez niektóre z bardziej wybrednych aspektów tej techniki. Na przykład nie można stosować warunków obniżających, nie można stosować EDTA i wielu rodzajów detergentów. Niedawne postępy w interferometrii podwójnej polaryzacji są podatne na EDTA i szersze stosowanie odczynników, a zastosowanie takich znaczników specyficznych dla danego miejsca znacznie upraszcza bezpośredni pomiar związanych z nimi zmian konformacyjnych.
znaczniki Fluorescencyjneedit
opracowano również znaczniki Cydyge Heksahistadyny. Te używać niklowy kowalencyjny koordynacja EDTA grupy przyłączać fluorophores w celu tworzyć barwnik który przyłączać polihistidine znacznik. Wykazano, że technika ta jest skuteczna w śledzeniu migracji i handlu białkami. Odnotowano również ostatnie odkrycia, które pokazują, że technika ta może być skuteczna w celu pomiaru odległości Poprzez Fluorescencyjny transfer energii rezonansowej.
znaczniki Fluorohistydynyedytuj
zgłoszono stosowanie znacznika polifluorohistydyny w systemach translacji in vitro. W tym systemie stosuje się Rozszerzony kod genetyczny, w którym histydyna jest zastępowana przez 4-fluorohistydynę. Fluorowany analog jest włączany do peptydów poprzez złagodzoną specyficzność substratową ligazy histydyny-tRNA i obniża ogólny pKa znacznika. Pozwala to na selektywne wzbogacanie peptydów znakowanych polifluorohistydyną w obecności złożonych mieszanin tradycyjnych znaczników polihystydyny poprzez zmianę pH buforów myjących.
