N-terminal sekvensering, ofta kallad Edman-sekvensering eller Edman-nedbrytning är en viktig teknik i proteinstudie och förblir ett unikt tillvägagångssätt som kan ge nya proteinsekvensdata. Det är också den föredragna tekniken för snabb proteinuttrycksbekräftelse.
kemin för detta tillvägagångssätt introducerades först 1950 av P. Edman från Lunds universitet i Sverige och vidareutvecklades under sitt arbete i Melbourne, Australien till vad som tros vara den första automatiserade peptidsekvenseringsanordningen.
Edmans Kemi
Fig 1. Edman-nedbrytningskemi för N-terminal proteinsekvensering.
de kemiska reaktionerna som ger den hydroliserade N-terminala märkta aminosyran visas i fig 1. Varje cykel innehåller i huvudsak 3 steg:
- koppling av fenylisotiocyanat (PITC, Edman-reagens) till alfaaminen i polypeptidkedjan under basiska förhållanden för att bilda en fenyltiokarbamyl (PTC)-del.
- klyvning under milda sura förhållanden genererar en fri aminoterminal på polypeptiden och en anilinotiazolinon (ATZ) adducerad aminosyra.
- den senare extraheras och omvandlas vidare till ett mer stabilt fenyltiohydantoin (PTH) derivat.
den resulterande PTH-återstoden analyseras med HPLC och retentionstider jämfört med standarderna PTH-aminosyror.
sidoreaktioner och biprodukter
Sekvenseringscykelkemi och upparbetning är väl kontrollerad och ger perfekt definierade arter, det finns några biprodukter som detekteras under analys.
som visas i Figur 2 kommer de huvudsakligen från PITC-hydrolys och metanolys under cykeln och inkluderar difenyltiourea (DPTU), N-fenyl,O-metyl-tiokarbonat (PMTC) och difenylurea (DPU), biprodukter som samextrakt och sameluterar med PTH-aminosyror.
