ett syndrom av mutualism förstärker livsstilen för en sloth

introduktion

medan växtätande är den dominerande foderstrategin bland däggdjur, arboreala växtätare är ytterst sällsynta. Faktum är att mindre än 4% av alla däggdjursgener innehåller arter som till viss del är arboreala och växtätande, och endast 10 arter av däggdjur (eller mindre än 0,2% av däggdjursdiversiteten) anses vara specialiserade arboreala växtätare . Arter som foder på växtmaterial i träd har en mycket begränsad livsstil. Å ena sidan måste de vara små och lätta för att kunna stödjas i baldakinen; å andra sidan begränsar liten kroppsstorlek matsmältningskapaciteten, särskilt för bearbetning av växtmaterial, som är rik på fiber men låg i smältbara näringsämnen. Så, även om utvecklingen mot arboreal växtätare finns i taxonomiskt olika däggdjursgrupper, inklusive primater, träddjur och pungdjur, väger alla mellan 1 och 14 kg . Således verkar sällsyntheten i denna livsstil och konvergens av kroppsstorlek bland växtätande och arboreala däggdjur återspegla begränsningar av näringsenergi på kroppsstorlek . För att övervinna sådana begränsningar har arboreala växtätare utvecklats dramatiska anatomiska (t.ex. idisslare-liknande pregastriska matsmältningsorgan), fysiologiska (t. ex. deprimerade metaboliska hastigheter) och beteendemässiga (t. ex. strikta kostpreferenser) anpassningar.

sengångare, eller los perezosos (’lazierna’) på spanska, är långsamma neotropiska däggdjur. De två fylogenetiska grupperna, två – (Choloepus spp.) och tre-toed (Bradypus spp.) sloths (Figur 1a,b), divergerade runt 40 Ma och är Ekologiskt helt annorlunda. Även om båda är medelstora foregut-jäsande arboreala däggdjur , har två-toed doven relativt stora hemområden ( men upp till 140 ha) och en relativt varierad diet av djurmaterial, frukt och löv, medan tre-toed doven har mycket begränsade hemområden ( range = 0.3-15.0 ha) och betraktas som strikta folivorer . Dessutom är enskilda tre-toed doven specialister, som stannar och konsumerar löv från endast några få trädslag i skogen . På grund av deras näringsfattiga och giftiga diet har tre-toed doven den långsammaste graden av matsmältning för alla däggdjur . För att redogöra för denna lågenergiupplupning har tre-toed doven en mycket låg metabolisk hastighet, mindre än hälften av det som förväntas för deras massa .

ungefär en gång i veckan, tre-toed sengångare ner från trädkronorna till basen av deras modal träd, där de skapar en fördjupning i marken med sin vestigial svans, och deponera sin dynga. Efter avföring täcker doven deras latrin med lövskräp och stiger upp till baldakinen . Två-toed sloths defecate från baldakinen eller på marken, speciellt när man byter träd (vilket de gör ofta) , och deras rutin, vad gäller både frekvens och platstrohet, är mycket mindre begränsad . Fallande ett träd är både riskabelt och energiskt kostsamt för någon lättja. Faktiskt, det är den främsta orsaken till dödlighet för en lättja; mer än hälften av alla vuxna lättja dödlighet vi har dokumenterat var depredation händelser när sengångare var på eller nära marken . Dessutom uppskattar vi att den genomsnittliga kostnaden för att sjunka från baldakinen för att defekera utgör cirka 8% av en sloths dagliga energiska budget (se det elektroniska tilläggsmaterialet för detaljer). Med tanke på den ökade risken och energiska kostnaden för en sloth att defekera på skogsbotten, kan man förvänta sig att det är ett viktigt fitnessförbättrande beteende. Föreslagna fördelarna med detta beteende till tre-toed sengångare inkluderar gödsling sina föredragna träd, kommunicera med andra sengångare via latriner eller undvika upptäckt från rovdjur . Med tanke på de näringsbegränsningar som införts av livsstilen hos träddjur, antog vi att detta beteende skulle kunna drivas av en kryptisk, men ändå viktig, näringsinmatning.

båda arterna av sengångare har en mångsidig sammansättning av symbiotiska mikroorganismer i sin päls, inklusive arter av alger, leddjur och detritivorösa svampar, varav många bara finns inom det phoretiska ekosystemet som bor i lättja päls. Grönalger (Trichophilus spp.) är särskilt rikliga . Individuella hår av tre-toed sloths har unika tvärgående sprickor, vilket gör att håraxeln blir mättad med regnvatten, och vilka alger koloniserar och växer hydroponiskt . Ett kommensalt förhållande har också tillskrivits doven och pyralidmoths (Cryptoses spp.), där malar kräver föreningen ( + ), men eftersom de inte matar på doven, ålägger ingen konsekvens (0) på deras värd . När en lättja ned ett träd och defecates, gravida kvinnliga nattfjärilar lämnar lättja och oviposit i den färska avföring. Larver är koprafagous, utvecklas helt inom dynga, och vuxna dyka upp och flyga till trädkronorna för att söka sina parning grunder i lättja päls att fortsätta sin livscykel. Även tre-toed sengångare regelbundet autogroom, de är ineffektiva i att ta bort lättja malar . Eftersom livscykeln för pyralidmoths är helt beroende av dessa annars oförklarliga beteenden i tre-toed sloths, föreslog vi att moth–sloth-interaktionen faktiskt kan vara en viktig ömsesidighet, där doven också gynnas på grund av deras förening (+/+).

Mutualisms-gemensamt fördelaktiga interaktioner mellan medlemmar av olika arter—är allestädes närvarande i naturen och bland de viktigaste av alla ekologiska interaktioner . Allt från diffusa och indirekta till tätt sammanväxta direkta interaktioner mellan flera arter , mutualisms har tidigare åberopats för att redogöra för annars oförklarliga beteenden , såsom ’renare fisk’ avlägsna ektoparasiter från klient rev fisk , eller myror försvara akaciaträd, och som en mekanism genom vilken näringsbegränsade organismer odla och upprätthålla en näringskälla, som de som observerats i fungikulturella system av blad fräs myror . Med tanke på de skenbart unrewarded risker lättja verkar vara bestående på uppdrag av nattfjärilar, vi hypotesen att de phoretic symbionter, tidigare tros ha en kommensal relation med sengångare, var i själva verket förstärka detta förhållande genom att ge näring ingångar till sina värdar.

för att undersöka förhållandet mellan sengångare och deras phoretic symbionts, vi fångade vuxna två-och tre-toed sengångare och kvantifierade antalet pyralid nattfjärilar angriper varje individ, liksom andra viktiga ekosystemkomponenter inom lättja päls, inklusive koncentrationen av oorganiskt kväve och fosfor, och algbiomassa på deras päls. Vi samlade också digesta från forestomach of sloths för att avgöra om samhällsmedlemmar inom pälsen konsumerades. Vi förutspådde att det styva beteendet som observerades i tre-toed doven främjas moth angrepp, och moth densitet skulle vara större jämfört med två-toed doven. Vi förutspådde vidare att eftersom malar är en av de enda portalerna av exogent organiskt material till detta ekosystem, skulle ökande maltäthet främja näringstillgänglighet och produktivitet inom lättja päls och potentiellt ge näringsinsatser för att underlätta några av de begränsningar som denna specialiserade arboreala växtätare står inför.

Material och metoder

(A) som beskriver ekosystemet på en lättja

vi genomförde fältarbete cirka 85 km nordost om San Jos Brasilian, Costa Rica (10.32 Portugals n, -83.59 Portugals W). Både brun-throated tre-toed sloths (Bradypus variegatus) och Hoffmanns två-toed sloths (Choloepus hoffmanni) är relativt rikliga över vår studieplats. Fältarbete genomfördes enligt vad som föreskrivs och godkänts av Iacuc-protokoll A01424 av University of Wisconsin-Madisonoch följde riktlinjerna för användning av däggdjur i forskning som anges av American Society of Mammalogists. Tillträde beviljades av den privata markägaren, och vårt projekt och provsamling godkändes av Ministerio de Ambiente, Energia y Telecomunicaciones, Sistema Nacional de Portugreas de Conservaci, Costa Rica. Alla prover importerades till USA med CITES och USA Fish and Wildlife Service godkännande. För att dokumentera mal-och algsamhället, samt kvantifiera nivåer av oorganiskt kväve och fosfor i lättja päls, fångade vi tidigare markerade vuxna två- (n = 14) och tre-toed (n = 19) doven efter standardprocedurer i augusti 2012. Eftersom unga sengångare ofta saknar alger och verkar förvärva sin alggemenskap från sin mor , inkluderade vi inte ungdomar i våra analyser. Vi klippte ett hårlås från dorsum av varje Dov och samlade alla malar från doven med ett ryggradslöst vakuum. I genomsnitt samlade vi 15,2 (2,9 2,9; intervall = 4-39) och 4,5 (1,3 1,3; intervall = 0-21) moths från respektive tre – och två-toed sloths. För att kvantifiera koncentrationerna av oorganiskt kväve och fosfor samplade vi (0,1 g) lättja päls och tvättade den med 15 ml avjoniserat vatten i 15 minuter. Tvätten filtrerades genom ett 0,45 oc-filter för sprutmembran och analyserades för och med hjälp av en flödesinjektionsanalysator (Quickchem 8000 FIA, Lachat-instrument) och totalfosfor med hjälp av en ICP/oes (Iris Advantage, Thermo-Fisher). Moths identifierades (Cryptoses choloepi Dyar; Pyralidae: Chrysauginae) vid de systematiska Entomologilaboratorierna (USDA, Agricultural Research Service). Vi vägde varje mal (±0,1 µg), och delas den totala biomassan av mal angrepp av massan av lättja (±0.1 kg) för att redogöra för individuella skillnader i kroppsstorlek; även utan skalning upptäckte vi emellertid ett signifikant samband mellan och både antal malar och total mal biomassa (se elektroniskt tilläggsmaterial, figur S1).

vi mätte klorofyll a-koncentrationen av den mikrobiella biomassan i pälsen på varje Dov via fluorometri. I korthet var 0,01 g päls från varje lättja sonicated i ddH2O 1 kg och metanol 3 kg (för ca. 30 min vardera) för att separera algceller från pälsen (se elektroniskt tilläggsmaterial, figur S2); filtratet från tvätten centrifugerades och mättes på en fluorometer för att beräkna koncentrationen av klorofyll. Våra uppskattningar av algbiomassa bekräftades av förändringen i pälsmassan efter ultraljudsbehandling (dvs. minskningen av pälsmassan efter algavlägsnande var relaterad till klorofyll a-koncentration). Vi använde den förändringen i pälsmassan efter ultraljudsbehandling för att approximera biomassan av alger i varje prov. Vi skalade sedan vår uppskattning av algbiomassa från provet för att approximera den totala massan av alger på hela lättja genom att anta att 20% av lättja kroppsmassa var päls och att den observerade procentuella förändringen i pälsprover från rengöring var konstant över djurets yta. Vi jämförde skillnader mellan två-och tre-toed sengångare i skalad mal biomassa, koncentrationer och algbiomassa med t-test, och undersökte förhållandet mellan mal biomassa och , och mellan med arter som en kategorisk variabel. Eftersom interaktionen för arter och prediktorvariabeln var icke-signifikant för båda mal-arter (t = 1,09, p = 0,28) och (t = 1,40, p = 0.17) rapporterade vi den enkla linjära regressionsmodellen med den kontinuerliga variabeln (t.ex. moth biomassa eller ).

b) in vitro-fermentationsexperiment

för att kvantifiera algernas smältbarhet i pälsen till organiska syror från pregastrisk mikrobiell jäsning utfördes in vitro-fermentationer med användning av ett ruminalt inokulum, ett lättillgängligt mikrobiellt samhälle med kapacitet att bryta ned en mängd olika växtkomponenter. Inokulatet kompositerades från två Holstein mjölkkor (Bos taurus) och bereddes som beskrivits tidigare , förutom att den pressade ruminalvätskan späddes ut till en OD525 av 5.0 med reducerad buffert som innehöll 1 g tryptikaspepton per liter. Fermentationer utfördes i 5 ml glasserumflaskor (Wheaton Scientific) som innehöll 150 mg lufttorkad lättja päls från två-(n = 10) och tre – toed sengångare (n = 10). För att bedöma bidraget från alger och organiskt material till jäsningen, vi ingår flaskor av päls från samma sengångare, men som hade tvättats och sonicated i metanol för att avlägsna alger och andra tillhörande organiskt material. Fyra tomma injektionsflaskor med endast rominalt inokulum och reducerad buffert analyserades också. Injektionsflaskorna gasades först kraftigt med CO2 i 2 minuter och förseglades sedan tätt med #00 butylgummiproppar. Utspätt ruminalt inokulum (2,00 ml) tillsattes under CO2-gasning, och injektionsflaskan förseglades med en flänsad butylgummipropp och säkrades med en aluminiumkrympförsegling; dessa inokuleringar utfördes i ett 39 C-rum efter temperaturjämvikt av den utspädda ruminalvätskan. Med undantag för kraftig handskakning vid ungefär 0, 1, 2, 4 och 16 timmar inkuberades injektionsflaskorna i upprätt läge utan att skaka. Efter 24 h inkubation, flaskor var uncapped och 1,00 ml avjoniserat vatten tillsattes. Vätskeinnehållet blandades flera gånger med en mikropipetter och 1,00 ml av vätskan avlägsnades för mikrocentrifugering (12 000 kg, 10 min, 4 c). Supernatanten analyserades för organiska syror av HPLC . Nettoproduktion av enskilda och totala flyktiga fettsyror (VFA; efter subtraktion av koncentrationer i ämnen) analyserades med en blandad modell i SAS V.9.2 med lättja arter och pälsbehandling (tvättad kontra otvättad) som klassvariabler, en art behandling av behandling med sackarios, och med enskilt djur som slumpvariabel. Uppgifterna (se elektroniskt tilläggsmaterial, tabell S1) avslöjade att C2–C5 rak kedja VFA (ättiksyra genom valeric) härledd främst från kolhydratfermentering producerades i högre mängder från otvättad päls än från tvättad päls, och i päls från tre-toed doven än från två-toed doven. Däremot var produktionen av grenad kedja VFA (isobutyric, 2-methylbutyric och isovaleric), som är unikt härledda från aminosyrafermentationer (specifikt de grenade aminosyrorna leucin, isoleucin och valin) låg och skilde sig inte mellan arter eller med behandling (p > 0.30), vilket tyder på minimal kapacitet för pregastrisk jäsning av algprotein.

(c) kompositionsanalys av alger och växter

vi genomförde kompositionsanalyser för kolhydrater, proteiner och lipider av algprover extraherade från pälsen av två- (n = 10) och tre-toed (n = 10) sengångare, samt bladprover från de sex mest konsumerade växtarterna i procent av torrsubstanshalten. För kolhydrat-och proteinanalys suspenderades prover (1-7 mg, vägdes till 0,001 mg) i 200-600 oktl av 0,2 M NaOH, upphettades vid 80 okt C i 40 min med frekvent blandning genom inversion och kyldes till rumstemperatur. Efter neutralisering med 0.38 volymer av 10% (v/v) isättika, protein analyserades med Bradford-metoden med användning av Coomassie Plus-reagens (BioRad) med lysozym som standard; kolhydrater analyserades med fenol-svavelsyrametoden med användning av glukos som standard. För lipidextraktioner , lufttorkade (60 CCB) alger (ca. 50 mg) och blad (100-200 mg) suspenderades i 2 ml CHCl3, 2 ml metanol och 1 ml H2O i skruvlock rör med Teflon liners. Efter vortexing i 2 minuter centrifugerades rören (2500 kcal g, 10 min, rumstemperatur) och kloroformfasen återhämtades. Det återstående materialet extraherades ytterligare tre gånger, var och en med 2 ml kloroform. De fyra kloroformextrakten poolades och behandlades med 3 ml mättad NaCl i vatten. Efter den slutliga centrifugeringen återvanns kloroformfasen och indunstades till ungefär 0,5 ml volym under N2. De koncentrerade extrakten överfördes kvantitativt med CHCl3-tvättar till förvägda 1,5 ml mikrofugrör och CHCl3 indunstades. Mikrofugrören lufttorkades sedan över natten vid 60 kcal C före vägning. Tomma rör användes för att korrigera för viktminskning av tomma mikrofugrör vid torkning.

(D) identifiera alger i digesta av sengångare

vi samlade digesta från forestomach av två – (n = 16) och tre-toed sengångare (n = 12) via gastric sondmatning för att avgöra om alger hade konsumerats av sengångare. Vi filtrerade en 2 ml alikvot av digesta genom en 60 oz. m sikt för att utesluta stora partiklar. Vi förberedde sedan objektglas med hjälp av 30 occyl filtrerad digesta, och tittade på varje bild med ett sammansatt ljusmikroskop vid 400 oc-förstoring. Vi räknade 100 celler av alger eller cyanobakteriellt material för varje bild och fotograferade varje cell som detekterades. Alger och cyanobakterier identifierades med högsta möjliga taxonomiska upplösning och representativa alg-och cyanobakteriegrupper fotograferades (se elektroniskt tilläggsmaterial, figur S3).

vi jämförde algsamhället som upptäcktes i digesta med det på pälsen av två- (n = 5) och tre-toed (n = 5) doven. Päls från dessa individer placerades i ett mikrocentrifugrör innehållande 1 ml ddH2O och blötläggdes i 1 h, omrördes var 15: e minut i 5 min. Päls avlägsnades från flaskor medan supernatanten användes för mikroskopfästen. Objektglas framställdes med användning av 30 oc supernatant, betraktade med användning av ett sammansatt ljusmikroskop vid 400 oc-förstoring och identifierades som beskrivits ovan. Fotografier av 100 alg-och cyanobakteriella celler från varje bild samlades in.

resultat och diskussion

som förutsagt, tre-toed sengångare hyste fler malar (figur 1C), liksom större koncentrationer av (figur 1D) och ökad biomassa av alger (figur 1E) i deras päls än två-toed sengångare. Vi hittade en liknande trend, men upptäckte inte en signifikant (p > 0.05) skillnad, i eller total fosfor (huvudsakligen i form av ) mellan arten (se elektroniskt tilläggsmaterial, figur S4). Men som vanligt observeras i jordar kommer dessa näringsämnen sannolikt att snabbt förvärvas av fotosyntetiska organismer eller lakas ut under regnskurar . Oavsett lättja arter, koncentration var positivt relaterad till antalet pyralid nattfjärilar i pälsen (figur 2a), och biomassan av alger ökade också med koncentrationen av i pälsen av sengångare (Figur 2B).

vi uppskattar att doven i genomsnitt har 125,5 g (14,8 g, 1 s. e.) mikrobiell biomassa (huvudsakligen alger) i pälsen, vilket motsvarar ungefär 2,6% (0,2%) av deras kroppsmassa. Våra in vitro-fermentationsexperiment visade att alger i lättja päls är också mycket lättsmält, att VFA produktion från alger rötning är främst förknippad med kolhydrat jäsning, och att päls av tre-toed sengångare innehåller organiskt material som är tillräckligt för att ge 24,4 mg VFA·(g fur−1) från pregastrisk jäsning (SE Elektronisk kompletterande material, tabell S1), nästan dubbelt så mycket jämfört med två-toed sengångare (p < 0,001). Kompositionsanalys av alger och blad av växtarter som föredras av sengångare avslöjade att båda föremålen var rika på kolhydrater (25.7% 1,4 1,4 för alger jämfört med 42,4% 3,5 för växter; se elektroniskt tilläggsmaterial, tabell S2), och hade motsvarande mängder protein(5,0% 0,39 0,3). Jämfört med växtblad var emellertid mikroalger tre till fem gånger rikare i lipidinnehåll-alger från två-och tre-toed doven var 45,2% (4,0 xnumx xnumx xnumx (0,8 xnumx xnumx xnumx xnumx (0,8 xnumx xnumx) lipid (se elektroniskt tilläggsmaterial, tabell S2). Lipidinnehållet i mikroalger är omvänt relaterat till oorganiska kvävehalter , vilket kan förklara skillnaden i lipidinnehåll i Alger mellan lättja arter. Oavsett skulle ett livsmedel med denna höga lipidkomposition ge en särskilt rik (över dubbelt så stor som jämfört med protein eller kolhydrat per gram) och snabb energikälla till doven, eftersom lipider vanligtvis skulle kringgå den pregastriska jäsningsprocessen.

inte överraskande, samma art av alg inträffade i päls och digesta av både två – och tre-toed sengångare. Specifikt identifierade vi Trichophilus spp. i digesta av två av de tre-toed sengångare (eller 17%) och sex av de två-toed sengångare samplade (eller 38%)—denna symbiotiska alg är endast känd för att bebo pälsen av sengångare (se elektroniskt kompletterande material, figur S3) . Det faktum att algerna är lätt smältbara men ändå detekterades i vår begränsade provstorlek tyder på att frekvensen av intagna alger sannolikt kommer att vara hög.

slutsats

våra data tyder på att en serie länkade mutualisms uppstår mellan doven, malar och alger (figur 3). Specifikt verkar sengångare främja pyralidmoth-angrepp genom att gå ner till trädets bas för att defekera och hjälpa moths livscykel , även inför ökad predationsrisk och betydande energiska kostnader . Moths i pälsen av sengångare fungerar i sin tur som en portal för näringsämnen, som kopplar ekosystemet inom lättja päls till omgivningen. Inom sloths ekosystem är svampar vanliga och vi postulerar att malar mineraliseras av denna rikliga gemenskap av sönderdelare. Alternativt kan malar direkt transportera organiskt avfall från dynghögen till pälsen. Oavsett mekanismen ökade ökande malbiomassa oorganiska kvävehalter, vilket tycktes öka tillväxten av algsamhällen på lättja päls. Sloths konsumerar alger, förmodligen via autogrooming, för näringsmässiga fördelar. Våra VFA-och kompositionsdata tyder på att alger på pälsen av sengångare är särskilt rika på smältbara kolhydrater och lipider. Kort sagt föreslår vi att sengångare betar de ’alger-trädgårdar’ som de har härlett från en trevägs ömsesidighet (figur 3).

förutom att ge näring är det möjligt att algodling förbättrar lättja överlevnad via kamouflage minska dödligheten från antenn rovdjur . Dessa två ultimata mekanismer för algodling utesluter inte varandra, men vi spekulerar i att kamouflaget från alger är sekundärt till näringstillskott. För det första måste fördelen med ökad döljning i baldakinen vara mycket stark för att kompensera de höga predationshastigheterna som uppstår när de faller ner i trädet för att defekera, men alg–sloth-symbiosen verkar inte relaterad till fördelningen av den primära antennen rovdjur av sengångare, harpy eagle (harpia harpyja). För det andra föreslår tidigare konstruerade energibudgetar för tre-toed sloths att dagliga energiförbrukning faktiskt kan överstiga intaget , vilket kan vara från beräkningsfel eller för att en kryptisk matvara, som alger, har missats. En oredovisad matkälla skulle hjälpa till att förklara varför tre-toed sloths är svåra att hålla väl näring i sanitiserade fångstanläggningar . Slutligen var mutualisms associerade med den två-toed sloth, som är den mer vagila och mindre begränsade forager, mer tvetydiga. Två-toed sengångare hade betydligt färre malar och mindre oorganiskt kväve och alger, även om de förmodligen står inför liknande predationstryck i skogstaket. Verkligen, två – och tre-toed sengångare från samma geografiska område hyser fylogenetiskt distinkta grupper av Trichophilus spp., vilket tyder på ett långt koevolutionärt förhållande mellan sengångare och deras algsamhälle .

oavsett fördel alger ger sengångare, detta komplexa syndrom av mutualisms—bland malar, sengångare och alger—verkar ha låst tre-toed sengångare i en evolutionär avvägning som kräver att möta ökad predation risk för att bevara kopplade mutualisms. Att stödja moths livscykel kan förklara varför tre – toed sloths har en hög trohet mot bara några få modala träd och en markant vilja att defekera i vad som är för en sloth den farligaste delen av skogen. Dessa mutualisms kan också bidra till sloths framgång som en arboreal växtätare, en av de mest begränsade och sällsynta foderstrategierna bland ryggradsdjur . Vår studie är den första som föreslår att unika ekologiska interaktioner, förutom fysiologiska och anatomiska anpassningar, kan främja en arboreal och växtätande livsstil; framtida experiment som testar de mekanistiska kopplingarna och förmodade fördelarna med interaktionerna mellan doven, malar och alger hjälper till att reta isär den exakta naturen hos dessa kopplingar.

Finansieringsförklaring

finansieringen tillhandahölls av National Science Foundation (DEB-1257535), Milwaukee Public Museum, University of Wisconsin–Madison och American Society of Mammalogists.

fotnoter