flerfärgad färgning med fluorescerande färgämnen används aktivt för att observera fördelningen av biologiska material (såsom proteiner, lipider, nukleinsyror och joner) inom området vävnad och cellforskning. Detektionstekniken för fluorescensobservation har avancerat till en nivå vid vilken en enda fluorescerande färgämnesmolekyl kan detekteras under de bästa omständigheterna. Detta avsnitt granskar flera av de viktiga aspekterna av fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), en ny fluorescensmikroskopiteknik. Förutom flerfärgsfärgning kan fluorescens livstidsavbildning också användas för att visualisera de faktorer som påverkar fluorescensens livstidsegenskaper hos färgmolekylen, det vill säga tillståndet för miljön runt molekylen.
Våglängdsspektroskopi
konventionell fluorescensmikroskopi använder sig av färgegenskaperna hos fluorescerande färgämnen, det vill säga identifiering baseras på skillnader i fluorescensspektrala egenskaper mellan färgämnen. Med denna teknik kan fem eller sex färgämnen i våglängdsområdet från ultraviolett till nära infraröd användas samtidigt under mikroskopi utan förvirring mellan färger.
Livstidsspektroskopi
varje fluorescerande färgämne har sin egen livstid i det upphetsade tillståndet. Genom att detektera skillnader i livstid är det möjligt att skilja även färgämnen med samma fluorescerande färg samt att identifiera autofluorescens. Dessutom kan höga signal-till-brus-bilder erhållas genom att använda en sond med mycket lång livslängd jämfört med den för de fluorescerande färgämnen som normalt används. Till exempel, platina coproporphyrin har en livstid av millisekund ordning medan livstiderna för vanliga fluorescerande färgämnen är av nanosekund ordning. Sådana relativt långlivade fluorescerande färgämnen kommer snart att användas som sonder för DNA-detektion på chips.
fluorescens livstidsavbildning gör det också möjligt att erhålla information om molekylerna medan man observerar en levande cell. De faktorer som påverkar fluorescensens livstid inkluderar jonintensitet, hydrofoba egenskaper, syrekoncentration, molekylär bindning och molekylär interaktion genom energiöverföring när två proteiner närmar sig varandra. Livslängden är dock oberoende av färgämneskoncentration, fotoblekning, ljusspridning och exciteringsljusintensitet. Därför tillåter fluorescens livstid avbildning oss att utföra noggrann jonkoncentrationsmätning och fluorescens resonans energiöverföring (FRET) analys.
det finns två metoder för fluorescens livstidsavbildning: tidsdomänmetoden och frekvensdomänmetoden.
- Tidsdomänflim-i vissa fall av fördröjning efter excitation med en pulslaser kan fluorescensbilden erhållas genom bildförstärkarens grindoperation. Livslängden mäts i nanosekunder av en laser med en pulsvaraktighet på några hundra pikosekunder och en slutare på nanosekundnivå eftersom livslängden för ett excitationstillstånd vanligtvis är 1 till 20 nanosekunder. En höghastighetsgrindbildförstärkare är kommersiellt tillgänglig från Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japan). Fluorescensens livstid vid varje pixel kan också erhållas genom att mäta medan man varierar fördröjningstiden tills en grind öppnas. Fluorescens livstid bilder visas i pseudokolor enligt deras livstid.
- frekvensdomän FLIM-fluorescens livstid beräknas genom att mäta fasförskjutningen av fluorescens och minskningen i dess amplitud med hjälp av en detektor med en förstärkningsmodulator när lasern som används som exciteringsljuskälla moduleras (1 till 200 megahertz). Mätningen kan göras antingen genom laserskanning (fotomultiplikator) eller med hjälp av en laddningskopplad enhet (CCD).
applikationer
miljön som omger sonden detekteras baserat på det faktum att fluorescensens livstid är känslig för vätejonkoncentration (pH), syre och kalciumjonkoncentrationer. Bindningen eller interaktionen mellan molekyler kan också mätas i kombination med FRET.
avbildning av Kalciumjonkoncentration
när kalciumjonen binder till en fluorescerande sond såsom Fura-2, Fluo-3 eller Kalciumgrön, förändras både fluorescensens livstid och fluorescensintensiteten. Det konventionella förfarandet för jonkoncentrationsmätning fokuserar på förändringen i intensitet. Enligt förändringen av kalciumjonkoncentrationen förändras förhållandet mellan färgämnen mellan bunden och obunden kalciumjon, och detta leder därefter till en förändring i fluorescensens livstid för mätpunkten i provet. Förutom kalciumjonsonden är denna teknik också tillämplig på mätning av pH och andra joner såsom natriumjon och magnesiumjon.
Fluorescensresonans energiöverföring (FRET)
forskning bedrivs för närvarande på FRET av gröna fluorescerande protein (GFP) varianter (GFP med en annan fluorescensfärg). FRET gör det möjligt att mäta interaktioner (association eller dissociation) mellan två proteiner som är märkta med ett par fluorescensfärger. En donator fluorescerande färgämne har kortare excitation / emission våglängder som ger energi till en acceptor fluorescens färgämne. Livslängden för givarfärgets excitationstillstånd varierar beroende på om acceptorn (färgämnet som tar emot energin) existerar eller inte. Mätning baserad på livstid möjliggör bättre kvantifiering eftersom det inte är nödvändigt att överväga överlappningen av fluorescens under detektion.
klinisk bildbehandling
eftersom vissa vävnads-och cytodiagnostiska prover har stark autofluorescens har användningen av sonder med lång livslängd (upp till millisekunder) försökt. Sonder med lång livslängd är också användbara vid fluorescens in situ hybridisering (FISH) eftersom antalet färger som kan användas samtidigt är begränsat med denna teknik. Vätejonkoncentrationen i blod, liksom syre-och koldioxidtrycket, har redan uppmätts baserat på fluorescenslivstid, även om sådana mätningar fortfarande inte är möjliga under mikroskopi.
Internetresurser
- Centrum för fluorescensspektroskopi – värd Professor Joseph R. Lakowicz vid University of Maryland, denna webbplats är en utmärkt resurs för information om fluorescens livstid avbildning och andra aspekter av fluorescensspektroskopi och mikroskopi.
- Kentech Instruments-Kentech tillverkar högspännings solid state pulsgeneratorer och optiska gated imaging system för fluorescens livstid avbildning.
- Hamamatsu Photonics-förutom deras utmärkta sortiment av digitala kamerasystem tillverkar Hamamatsu också fotomultiplikatorer, lavinfotodioder och höghastighetsgrindbildförstärkare.
- PRS BioSciences-specialiserat på biologisk fluorescensmikroskopi, PRS Biosciences tillverkar en eftermarknad tids gated system som kan anpassas till många forskningsmikroskop.
