jämförelse mellan konventionell avkalkning och en Mikrovågsassisterad metod i benvävnad påverkad med Mycetom

Abstrakt

Mycetom är en livslång granulomatös sjukdom i subkutan vävnad och ben. Histopatologi är en underbyggd vägledande metod baserad på antagandet om en definitiv diagnos av mycetom. Det kräver effektiv bearbetning av vävnader inklusive benavkalkning. Avkalkningsprocessen måste säkerställa fullständigt avlägsnande av kalcium och även en korrekt bevarande av vävnads-och mikroorganismernas färgningsförmåga. Mål. Att jämföra den konventionella metoden som används vid avkalkning med mikrovågsmetoden med olika avkalkningslösningar. Olika egenskaper testades, inklusive hastigheten för avkalkning och morfologisk och svampbevarande i benvävnad påverkad med mycetom. Material och metoder. Tre avkalkningslösningar användes för att avlägsna kalcium från 50 benvävnadsprover som påverkades med mycetom, inklusive 10% neutral buffrad EDTA (pH 7,4), 5% salpetersyra och 5% saltsyra. Konventionella och mikrovågsmetoder användes. Hematoxylin-eosin (he) fläck, Gridleys fläck och Grocott hexamin-silver fläck användes för att utvärdera ben-och svampmorfologierna. Resultat. Avkalkningstiden för den konventionella metoden jämfört med mikrovågsmetoden med 10% EDTA (pH 7.4) tog 120 timmar och 29 timmar, medan 5% saltsyra och 5% salpetersyra tog 8 timmar och 3 timmar, separat. Dessutom är 10% EDTA det bästa avkalkningsmedlet för He-färgning och svampfläckar. 5% saltsyra och 5% salpetersyra kan användas för svampfärgning. Slutsats. Den aktuella studien undersökte effekterna av olika avkalkningsmedel samt två avkalkningsförfaranden på bevarande av benstrukturen och svampfärgning, vilket kommer att bidra till att utveckla lämpliga protokoll för analyser av benvävnaden som påverkas av mycetominfektion.

1. Introduktion

Mycetom är en livslång granulomatös, gradvis skadlig epidemisk sjukdom i huden och subkutan vävnad som kan utvecklas till djupare strukturer som muskler och ben och leda till omfattande förstörelse, främst av fötterna, vilket kräver breda lokala kirurgiska excisioner eller amputation av lemmar . Mycetom definieras av triumviratet av expansion, utmattande bihålor och existens av koloniala korn i de inflammatoriska exsudaterna . Infektion klassificeras som eumycetom (svampinfektion) eller aktinomycetom (bakteriell infektion) . Det är i stort sett ett tillstånd av tropiska och semitropiska regioner, märkbart Sudan . Madurella mycetomatis grödor är enorma, allt från 0,5 till 3 mm, och verkar rundade, ovala eller trilobed. De består av kors hyfer ingrodd i interstitiell brunaktig cement, bestående av melaninliknande, svartbrunt pigment . Histopatologi är en snabb indikativ metod såväl som fördelaktig process vid antagandet av en definitiv diagnos av mycetomsjukdom och innehåller en rapport som beskriver den morfologiska presentationen av orsaksmedlen. Det orsakande medlet kan fortfarande isoleras från den involverade benvävnaden . Avkalkning är ett grundläggande steg som vanligtvis uppnås för histopatologisk undersökning av ben . Mineralerna i ben består av kalcium och fosfor, och olösliga salter utgör mer än sextio procent av benvävnaden . Dessa mineraler ger benhårdhet och är orsaken till svårigheter vid vävnadsskärning med roterande mikrotomer . Sådana vävnader måste behandlas för att extrahera kalciumfosfat genom ett förfarande som kallas avkalkning, genom att göra vävnaden tillräckligt känslig för att skäras av mikrotomen. Avkalkning åstadkommes genom syror som bildar lösliga kalciumsalter eller kelatmedel som binder till kalciumjoner. De nuvarande konventionella avkalkningsmetoderna kännetecknas av mödosamma processer och det ihållande misslyckandet av vävnadens färgningsreaktion . I den konventionella metoden för avkalkning placeras benvävnader i en avkalkningsvätska vid rumstemperatur med förändringar av lösningen med jämna mellanrum tills slutpunkten uppnås. Mikrovågsavkalkning är en innovativ teknik jämfört med den konventionella metoden . I denna process placeras fasta vävnader i avkalkningslösningen i en mikrovågsugn för periodiska varaktigheter med vanliga skift av avkalkningsvätskor tills slutpunkten uppnås. Mikrovågsstrålning har genomförts för att påskynda förfarandet för avkalkning ungefär från dagar till timmar . Syftet med denna studie var att jämföra den konventionella metoden som används vid avkalkning med den modifierade mikrovågsmetoden med olika avkalkningslösningar. Olika egenskaper testades, inklusive hastigheten på avkalkning och morfologisk och svampbevarande i benvävnad som påverkades av Madurella mycetomatis-infektion.

2. Material och metoder

detta är en experimentell beskrivande studie som syftar till att jämföra det konventionella avkalkningsförfarandet med mikrovågsförbättrad avkalkning med avseende på vävnadsmorfologi som påverkas av mycetominfektion med hematoxylin och eosin, Gridley och Grocott hexamin-silver fläckar för fullständig identifiering av Madurella mycetomatis kausala organismer. Denna studie genomfördes vid Mycetoma Research Center i Soba Universitetssjukhus och Fakulteten för medicinsk laboratorievetenskap, University of Al Neelain. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter. Femtio amputerade lemmar som drabbats av mycetom samlades in. Benbiopsier skars med användning av en lämplig såg i 5 mm tjocka bitar och fixerades sedan i 10% formell saltlösning i 48 timmar. De tvättades under rinnande kranvatten i 30 minuter för att avlägsna fixativet.

2.1. Konventionellt Avkalkningsförfarande

tre bitar av 5 mm tjocka sektioner av benbiopsier nedsänktes i tre 250 ml Pyrex Squat-bägare som vardera innehöll 100 ml 5% vattenhaltig saltsyra (HCl), 5% vattenhaltig salpetersyra (HNO3) och 10% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) placerade vid rumstemperatur (i genomsnitt 28 kcal C), se Tabell 1. Slutpunkten för avkalkning kontrollerades med användning av kalciumoxalatmetoden för de två syraavkalkningsmedlen (5% HNO3 och 5% HCl) efter ett två timmars intervall enligt följande: 5 ml av den använda avkalkningsvätskan togs och placerades i ett provrör, sedan tillsattes lakmuspapper och ammoniakhydroxid tillsattes droppe för droppe tills lakmuspapperet ändrades, vilket indikerar alkaliskt pH-avkalkningsvätska var klart. 5 ml mättad ammoniumoxalatlösning tillsattes när avkalkningslösningen blev grumlig, vilket indikerar närvaron av kalcium i benvävnad så att avkalkningslösningen ersattes med ny lösning och processen upprepades var 30: e minut tills avkalkningsprocessen slutfördes. För EDTA användes fysiska test av avkalkningsmedel där avkalkningsprocessen ansågs ha avslutats när benet lätt penetrerades genom en nål. De genomsnittliga totala avkalkade tiderna var 7 timmar och 30 minuter, 8 timmar och 120 timmar för 5% salpetersyra, 5% HCl respektive 10% EDTA.

2.2. Mikrovågsugnsprocedur

en mikrovågsugn (Midea Microwave 20l, 700W, Digital, EM720CFF) med en fast roterande platta användes. En glasbägare innehållande 100 ml destillerat vatten förvärmdes i 5 sekunder för att värma upp magnetronen. Detta ersattes av 100 ml färskt destillerat vatten och bestrålades för att bibehålla temperaturen vid cirka 41-43 kcal C. detta tog 15 sekunder. Glasbägaren tilldelades vid olika punkter i ugnen medan den bestrålades för att lösa provets bästa placering under mikrovågsavkalkning eftersom mikrovågsugnen som användes hade en konstant tidpunkt men inte en konstant temperatur. Tre bitar av 5 mm tjocka sektioner av benbiopsier nedsänktes i 250 ml Pyrex Squat bägare innehållande 100 ml 5% vattenhaltig saltsyra (HCl), 5% vattenhaltig salpetersyra (HNO3) och 10% EDTA. Sedan överfördes de till mikrovågsugnen, och proverna bestrålades i tio cykler om tio sekunder vardera (med 15 minuters intervall) under en total tid på 2-4 timmar för syraavkalkare (5% HNO3 och 5% HCl). Temperaturen hos avkalkningslösningen bibehölls vid omkring 41-43 kcal C. avkalkningslösningen och slutpunkten för avkalkningen kontrollerades och avkalkningslösningen ändrades upprepade gånger tills avkalkningen slutfördes. Slutpunkten för avkalkning kontrollerades med användning av kalciumoxalat och fysiska tester som nämnts ovan. De genomsnittliga totala avkalkade tiderna var 3 timmar och 45 minuter, 5 timmar och 30 minuter och 29 timmar och 4 minuter för 5% salpetersyra, 5% HCl respektive 10% EDTA. Efter fullständig avkalkning tvättades vävnaderna med destillerat vatten och överfördes till 0,3% ammoniaklösning i 5 minuter för att neutralisera den använda syran.

2.3. Vävnadsbehandling och färgning

proverna utsattes för automatisk vävnadsbehandling med hjälp av följande protokoll: benbiopsierna placerades i 10% formell saltlösning under en timme. Sedan, 50% alkohol en timme, 70% alkohol en timme, 90% alkohol en timme, följt av 100% alkohol tre förändringar varje två timmar vardera, xylen två förändringar, var och en för en och en halv timme, slutligen paraffinvax två förändringar vardera i två timmar. Vävnaderna var inbäddade i paraffinblock och sektionerades till en tjocklek av 5-6 kcal med användning av en roterande mikrotom. Sektioner färgades med Mayers hematoxylin, som beskrivits av Mayer 1903, och motfärgen i var och en var 1% eosin (HE) . Gridleys fläck användes för svampdemonstration som beskrivs av Gridley 1953); efter deparaffinisering och rehydrering placerades vävnadssektioner i 2% kromsyra i 30 minuter. De tvättades sedan väl med kranvatten, sköljdes med destillerat vatten och placerades sedan i Schiffs reagens i 20 minuter. De tvättades sedan i rinnande kranvatten i 10 minuter och sköljdes med 70% etanol och sedan med 95% etanol. De motfärgades med Metanil gul i en minut och sköljdes väl med destillerat vatten. Därefter dehydratiserades de i xylen och monterades i distyren, en mjukgörare och xylen (DPX). Därefter undersöktes sektionerna under ett mikroskop . Grocott hexamine-silver-metoden för svampar som beskrivits av Grocott 1955 användes också i vilka sektioner oxiderades med 4% vattenhaltig kromsyra i en timme, tvättades i vatten i några sekunder, behandlades med 1% natriummetabisulfit i en minut, tvättades i rinnande kranvatten i 3 minuter, sköljdes noggrant i destillerat vatten, placerades i förvärmd fungerande silverlösning i ett vattenbad vid 60 kg C i 20 minuter, sköljdes väl i destillerat vatten, tvättades med rinnande kranvatten i 5 minuter, motfärgades i fungerande ljusgrön i 15 sekunder, dehydratiserades och rensas i xylen och monteras i DPX, och slutligen undersöktes under ett mikroskop.

2.4. Utvärdering av resultat

sektioner utvärderades av en expert histopatolog. Kvaliteten på avkalkningsförfarandet och färgningsresultatet bedömdes och utvärderades också av tumregeln, och kvaliteten på avkalkningen utvärderades med följande kriterier: tiden för avkalkning, morfologisk bevarande av vävnadsmorfologi och madurella mycetomatis svampar av HE; Gridley och Grocott metenamin-silverfärgning graderades från 1 till 4 (1: Dålig, 2: rättvis, 3: bra och 4: utmärkt) .

2.5. Statistisk analys

dataanalys utfördes med hjälp av SPSS-programmet. Envägs ANOVA användes för att bevisa effekten av de tre avkalkningslösningarna på den kvantitativa analysen av sektionskvalitet och svampbevarande. Kruskal-Wallis-testet utfördes för att avgöra om det fanns en signifikant skillnad mellan de lösningar som testades för var och en av de utvärderade parametrarna tillsammans med de två experimenten. Skillnader med tolkades som statistiskt signifikanta.

3. Resultat

femtio fall av Madurella mycetomatis med svartkorn inkluderades i studien. Fötterna var den mest drabbade anatomiska regionen i 48 fall (96%) och två fall (4,0%) i handen. När det gäller tiden för avkalkning i olika experiment, bland de tre testade lösningarna, tog avkalkning med 10% EDTA (pH 7, 4) den längsta tiden för den konventionella metoden (upp till 120 timmar jämfört med 29 timmar med mikrovågsugnen) och användningen av en syraavkalkningslösning tog kortast tid från 8 timmar till 3 timmar för olika avkalkningsmetoder. Kvaliteten på vävnadsmorfologin hos olika typer av avkalkningslösning med användning av avkalkningsmikrovågsmetoden jämfört med den konventionella metoden med Mayers hematoxylin-och eosinfärgning med avseende på kärn-och cytoplasmatiskt utseende uppnådde varierande resultat. Dessutom verkade 10% EDTA-avkalkat Ben ha ett signifikant överlägset resultat (P-värde med chi-kvadrattest: 0,023) jämfört med 5% HNO3 och 5% HCl. Utmärkt färgningsrapport var 43 (86%) jämfört med 32 (64%), 42 (84%) mot 18 (36%) respektive 33 (66%) mot 1 (2%). Grocott metenamin-silverfläckmetoden användes för demonstration av madurella mycetomatis orsakande medel angående morfologin och ljusstyrkan hos svampar, och vävnadssektioner avkalkade med 10% EDTA, 5% HNO3 och 5% HCl med konventionella och mikrovågsmetoder visade signifikant bättre svampmorfologi (P-värde med chi-kvadrattest: 0.001) enligt följande: 33 (66%) kontra 32 (64%), 33 (66%) mot 39 (78%) respektive 22 (44%) mot 31 (62%). Den andra svampfläcken som användes för Madurella mycetomatis var Gridley-fläck angående svampmorfologi och färgningskvalitet hos ben avkalkade med 10% EDTA, 5% HNO3 och 5% HCl med konventionella och mikrovågsmetoder som visade signifikant bättre resultat (P-värde med chi-kvadrattest: 0.003) enligt följande: 43 (86%) kontra 41 (82%), 32 (64%) mot 34 (68%) respektive 23 (46%) mot 35 (70%). Dessa resultat sammanfattas i Tabell 2. Figur 1 visar färgningsresultaten med olika avkalkningsmedel och betingelser.

Figur 1

Demonstration av färgningsresultat med olika avkalkningsmedel och betingelser.

4. Diskussion

den histopatologiska identifieringen av orsaksmedlet för Madurella mycetomatis är väl etablerad eftersom det är guldstandardförfarandet; hårdvävnad och ben kräver emellertid speciell avkalkning för att bevara vävnadsstrukturen och orsaksmedlets morfologi. De orsakande medlen kan identifieras med hjälp av hematoxylin och eosin (HE) och svampar speciella fläckar, så benet kräver ett standardavkalkningsprotokoll som bevarar vävnad, orsakssambandsmorfologi och fläckförmåga. Benavkalkning är en tråkig teknik. Det kräver veckor, och bevarande av vävnadskonfigurationen beror på excellens och hastighet för avkalkningsförfarandet. En ny process med en mikrovågsugn realiserades för att påskynda avkalkningsprocessen . Valet av avkalkningsmedlet och sättet bestäms i grunden av metodens allvar , och de möjliga användningarna av mikrovågsenergi i histologiska tekniker dokumenterades först av Mayers 1970. Detta system för nonioniserande emissionsmetod trodde att påskynda avkalkningsprocessen . De molekylär kinetik orsakar sedan produktionen av energiförändring, som varar tills strålningen stannar . I denna studie var avkalkningstider rapporterade för mikrovågsförbättrad avkalkning och det konventionella avkalkningsförfarandet 29 och 120 timmar med 10% EDTA (pH 7.4), tre timmar och sju timmar med 5% salpetersyra och fem och åtta timmar med 5% HCl, respektive. Det är uppenbart att mikrovågsavkalkningsmetoden för benvävnad som drabbats av mycetominfektion var signifikant snabbare än den konventionella metoden. Dessutom hade 5% salpetersyra snabbare avkalkningsförmåga följt av 5% saltsyra och sedan EDTA (pH 7.4) för båda metoderna. Pitol et al. används ett hem mikrovågsugn för avlägsnande av kalcium i råttbenet med 8,5% EDTA-lösning och visade en minskning av försöksperioden från 45 dagar i den konventionella processen till 48 timmar i den mikrovågsassisterade processen. I detta arbete tog 10% EDTA-lösningen 120 timmar i den konventionella metoden och 29 timmar med mikrovågor för att uppnå fullständig avkalkning av benvävnaden som drabbats av mycetominfektion. Koncentrationen av EDTA i vårt experiment var mer än Pitol et al.studie. Förutom skillnader i storlek, tjocklek, och typer av benet, dessa kan vara möjliga förklaringar till ökningarna i tiden för avkalkning i Pitol et al.s studie som reducerades i vår miljö. Vidare tog avkalkning av benet som drabbades av mycetominfektion med den konventionella metoden med 5% salpetersyra sju timmar, medan mikrovågsugnsmetoden tog tre timmar. Jämförbara resultat uppnåddes av Balaton och Loget . Vidare minskades avkalkningstiderna i denna forskning från andra studier. De avkalkningstider som rapporterats för konventionella och mikrovågsmetoder varierade från en dag och fyra timmar till 5 dagar och anses vara låga i jämförelse med andra studier i gnagarbenet, som har rapporterat tider mellan 2 och 7 dagar med syraavkalkningslösningar respektive 10% EDTA (pH 7.4). Shibata och hans grupp rapporterade nästan liknande avkalkningstider som varierade från 1 dag till 7 dagar med 10% HCl, 10% salpetersyra och 10% EDTA. De använde emellertid syraavkalkare med högre koncentrationer . Uma et al. utvärderade effekterna av fyra olika avkalkningsvätskor med mikrovågsavkalkning i råttbenet och rapporterade 1 till 1,5 dagar för 5% salpetersyra och 7% HCl/2% EDTA. Emellertid tog 10% EDTA 14 till 26 dagar beroende på benets typ . I dessa studier varierade bentypen, naturen och storleken och skilde sig från de som analyserades här. Avkalkningsförfarandet var en viktig orsak till vävnadssektionens överlägsenhet och precisionen av färgning. Philipp et al. (2019) beskrev att avkalkningsmetoden orsakar betydande morfologiska förändringar som förändrar proteinstrukturen och påverkar vävnadens färgningsförmåga . I vår studie behandlades benet med 5% salpetersyra med den rutinmässiga manuella metoden, och det var svullnad i mjukvävnad och förlust av kärn-och svampfärgning jämfört med mikrovågsassisterad avkalkning. Syraavkalkningsmedel stör vanligtvis ben-och mjukvävnadskonstansen. Dessa specialeffekter i 5% salpetersyra beror på den tid som tagits och lösningens surhet. Således kommer snabbare avkalkning att orsaka större skada och större effekter i H&E och svamp speciell fläck. Flera svampar kan demonstreras med en histologisk sektion med histokemiska fläckar såsom Grocotts metenamin-silver (GMS) fläck och/eller Gridley (GS) fläck . Vissa svampar kan exakt demonstreras i vävnad baserat på morfologiska strukturer; emellertid tenderade igenkänningseffekten att minska efter långvarig fixering och avkalkning med konventionella metoder . I denna studie gav mikrovågsassisterad avkalkning överlägsen färgning jämfört med den konventionella metoden för morfologi med H&E och svampspeciell fläck, där 10% EDTA var lösningen som bäst bevarade vävnadsstrukturer och svampfärgningsförmåga trots att det tog lång tid för avkalkning.

5. Slutsats och rekommendationer

Avkalkning förstärkt med användning av en mikrovågsugn är en ny teknik för avkalkning. Denna teknik undersöktes i benvävnad som påverkades med madurella mycetomatis-infektion med 10% EDTA, 5% salpetersyra och 5% saltsyra som avkalkningsvätskor. Detta jämfördes med konventionell avkalkning vid rumstemperatur för att bestämma hastigheten på avkalkning och vävnadsmorfologi med Mayers hematoxylin-och eosin-fläck för benstrukturen och Grocott-och Gridley-fläckar för svampmorfologi. Bättre resultat uppnåddes jämfört med den konventionella metoden både i cellmorfologi och svampspor och hyfer med minskad svampljusstyrka vid rumstemperatur. Detta resultat kan bidra till att utveckla lämpliga protokoll för analyser av benvävnad som påverkas av mycetominfektion.

6. Begränsningar av föreliggande studie

en större provstorlek skulle ha gett mer avgörande resultat. Också, de tider som tas för avkalkning kommer sannolikt att vara olika om olika benvikter och andra benprover än händer används eftersom avkalkningstiden är beroende av hårdvävnadens storlek och strukturella densitet. Slutligen, eftersom vi har använt en inhemsk mikrovågsugn, kan våra temperaturinspelningar bara ha varit ungefärliga.

datatillgänglighet

datauppsättningarna som genererats under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

etiskt godkännande

denna studie godkändes av institutionell granskningsnämnd vid fakulteten för medicinsk laboratorievetenskap, University of Al Neelain.

intressekonflikter

författaren förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

erkännanden

författaren vill uttrycka sin uppriktiga tacksamhet till personalen vid Mycetoma Research Center, University of Khartoum, Khartoum, Sudan, och särskild uppskattning till professorerna Ahmed Hassan Fahal och Ahmed Mohammed El Hassan, emeritus professor i patologi, för deras hjälp.

kompletterande material

de material och reagenser som används för att stödja resultaten av denna studie ingår i tilläggsinformationen. (Kompletterande Material)