10.4.2 trehalos för kryokonservering av däggdjursceller
kryokonservering har vanligen använts för bevarande av celler under längre perioder vid extremt låga temperaturer. Fysiska förändringar som uppstår under frysning och upptining kan dock vara skadliga för cellöverlevnad och funktioner. Därför måste kryoskyddande medel läggas till cellerna under kryokonservering. Användningen av trehalos som ett kryoskyddande medel för celler framkom av uppfattningen att polyhydroxiföreningar krävs på båda sidor av cellmembranet för att cellerna ska bevaras under längre perioder . Trehalos har undersökts av flera grupper som ett skydd för kryopreservering av olika mänskliga celler.
Beattie et al. introducerade trehalos tillsammans med DMSO i pankreatiska Langerhans-celler med användning av termotropisk vätskefasövergång . Kryokonservering med trehalos resulterade i 92% återhämtning av vuxna öar, jämfört med endast 58% återhämtning med enbart DMSO. Fjorton gånger mer insulin hittades i transplantaten från holmar kryokonserverade med trehalos än de utan trehalos. Återhämtningen av humana fetala öliknande cellkluster (ICCs) kryokonserverad med trehalos var 94%, jämfört med endast 42% för dem utan trehalos. Vid transplantation i nakna möss observerades en 15-faldig ökning av insulininnehållet i transplantat från ICC-kryokonserverad med trehalos. Dessa resultat indikerar att tillsatsen av trehalos som kryopreservant leder till mycket hög överlevnad av Human pankreatisk endokrin vävnad.
Toner och medarbetare introducerade låga koncentrationer av trehalos i däggdjursceller med hjälp av en genetiskt konstruerad version av det porbildande proteinet alfa-hemolysin och fann att intracellulär trehalos kan förbättra överlevnaden av dessa celler under kryokonservering . Långsiktiga överlevnadshastigheter efter upptining av kryokonserverade musfibroblaster och humana keratinocyter var 80% respektive 70% vid en intracellulär trehaloskoncentration på 0,2 M. Intracellulär trehalos befanns också ha fördelaktig effekt på membranintegriteten hos torkade däggdjursceller, med mer än 90% återhämtning av intakt plasmamembran observerat vid torkning och lagring av cellerna under milda förhållanden i flera veckor .
effekten av trehalos på kryopreservering av humana hepatocyter undersöktes av Katenz et al. . Leverceller frysta i odlingsmedium med 10% DMSO och 0,2 M trehalos visade signifikant förbättring av cellens livskraft efter upptining och pläteringseffektivitet jämfört med DMSO ensam. Närvaron av trehalos under kryopreservering resulterade också i ökad total proteinnivå i de bifogade cellerna, högre albuminsekretionsnivåer och lägre aspartataminotransferasnivåer efter upptining.
stamceller är viktiga verktyg för undersökning av hematopoiesis, utveckling av nya terapeutiska strategier samt modellsystem för vissa sjukdomar. Trots utvecklingen inom kryokonservering är post-Tina celldöd fortfarande en viktig fråga. Martinetti et al. används trehalos för att kryopreservera rena hematopoietiska stam-och stamceller från perifert blod för att förhindra cellförlust som uppstår under normal kryopreservering . Uttrycket av ytstammarkören CD34 utvärderades och 1 M trehalos befanns ge förbättrad kryoskydd till CD34+ – celler med högre cellnummer och cellviabilitet jämfört med standardfrysningsmetoden med användning av DMSO. Dessutom behöll kryopreservering med trehalos under kortare och längre perioder förmågan hos CD34+ – celler att differentiera till megakaryopoietiska celler efter upptining. Dessa resultat tyder på trehalos förmåga att behålla stamcellernas livskraft och funktioner när de används som kryoskyddande medel.
långtidsförvaring av röda blodkroppar (RBC) och blodplättar samtidigt som hög grad av livskraft bibehålls har viktiga konsekvenser för blodtransfusion och klinisk medicin. Satpathy et al. beskrev en metod för att ladda RBC med trehalos från ett extracellulärt medium med användning av osmotisk obalans och fosfolipidfasövergång som resulterade i intracellulära trehaloskoncentrationer på 40 mm. Trehalos befanns utöva osmotiskt skydd av RBC under längre perioder. Frystorkning av de trehalosbelastade RBC: erna följt av rehydrering resulterade i 55% överlevnad med retention av deras morfologi. De överlevande cellerna syntetiserade ATP och 2,3-difosfoglycerat (DPG) och hade låga nivåer av metemoglobin. Aktiviteten av SOD och katalas och den sekundära strukturen av hemoglobin i de frystorkade RBC: erna var alla mycket lik de för färska RBC: er. Denna studie visade att trehalosbelastning krävdes för stabilisering av hemoglobin och gav ett viktigt steg mot kryokonservering av RBC.
den normala lagringstiden för humana blodplättar i blodbanker är 5 dagar varefter de kasseras, vilket resulterar i kronisk brist på blodplättar som krävs för transfusion. Som ett försök mot kryokonservering av blodplättar under längre perioder, Wolkers et al. beskrev en metod för att införa trehalos i cytoplasman hos humana blodplättar . Trehalos befanns lätt upptas av de mänskliga blodplättarna vid 37 kg c med en belastningseffektivitet på mer än 50%. Frystorkning och rehydrering av de trehalosbelastade blodplättarna resulterade i utmärkt återhämtning av intakta blodplättar med överlevnadshastighet på 85%. Dessa blodplättar svarade på ett nästan identiskt sätt på färska blodplättar mot agonister såsom trombin, ADP, kollagen och ristocetin. Membranmikrodomänerna och proteinkomponenterna i trehalosbelastade blodplättar bibehölls intakta efter frystorkning och rehydrering.
den skyddande effekten av trehalos demonstrerades också i dessikerade hornhinnepitelceller. Preinkubation av odlade hornhinnepitelceller med trehalos följt av torkning resulterade i signifikant minskning av andelen döda celler jämfört med kontrollmediet . Den skyddande effekten bekräftades också ex vivo i enukleerade svinögon, där vävnaden inkuberades med trehalos var synligt mjukare . Dessa resultat indikerar nyttan av trehalos i oftalmologi och dess potentiella tillämpning som en ögondroppe för torra ögonsyndrom.
användningen av trehalos för kryopreservering av organeller har visats av Yamaguchi et al., som använde trehalos som ett kryoskyddande medel för frysta mitokondrier . Mitokondrier frysta i närvaro av trehalos uppvisade mitokondriell yttre membran (MOM) integritet och lyhördhet för Bcl-2-familjeproteiner som liknar de hos färska mitokondrier. Ultrastrukturen, ATP-syntesen, transmembranpotentialen, kalciuminducerad svullnad och import och bearbetning av prekursorproteiner bevarades också i närvaro av trehalos. Detta är till skillnad från standard sackaros-mannitol buffert som används för frysning mitokondrier som ofta blir läckande. Således kunde trehalos behålla de flesta av de biologiska egenskaperna hos mitokondrier och trehalos-frysta mitokondrier kan användas för forskning om apoptos och andra mitokondriella funktioner som är beroende av MOM-integritet.
trehalos har använts för att bevara organ under längre perioder. En ”ET-Kyoto-lösning” utvecklades av Wadas grupp för bevarande av hundlunga under >30 timmar utan att påverka prestandan hos endotelceller och kärl . Långvarig stabilisering och bevarande av vacciner och antikroppar har också uppnåtts med användning av trehalos.
