Metoder för proteinrening: 4 metoder

denna artikel kastar ljus på de fyra metoderna för proteinrening.

de fyra metoderna för proteinrening är: (1) extraktion (2) Utfällning och differentiell solubilisering (3)ultracentrifugering och (4) kromatografiska metoder.

de metoder som används vid proteinrening kan grovt delas in i analytiska och preparativa metoder.

skillnaden är inte exakt, men den avgörande faktorn är mängden protein, som praktiskt taget kan renas med den metoden. Analysmetoder syftar till att detektera och identifiera ett protein i en blandning, medan preparativa metoder syftar till att producera stora mängder av proteinet för andra ändamål, såsom strukturbiologi eller industriell användning. I allmänhet kan de preparativa metoderna användas i analytiska tillämpningar, men inte tvärtom.

Metod # 1. Utvinning:

beroende på källan måste proteinet bringas i lösning genom att bryta vävnaden eller cellerna som innehåller den. Det finns flera metoder för att uppnå detta; upprepad frysning och upptining, ultraljudsbehandling, homogenisering genom högt tryck eller permeabilisering av organiska lösningsmedel. Valmetoden beror på hur bräckligt proteinet är och hur robust cellerna är.

efter denna extraktionsprocess kommer lösligt protein att vara i lösningsmedlet och kan separeras från cellmembran, DNA, etc. genom centrifugering. Extraktionsprocessen extraherar också proteaser, som börjar smälta proteinerna i lösningen. Om proteinet är känsligt för proteolys är det vanligtvis önskvärt att fortsätta snabbt och hålla extraktet kylt för att sakta ner proteolysen.

Metod # 2. Utfällning och differentiell solubilisering:

i bulkproteinrening är ett vanligt första steg för att isolera proteiner Utfällning med ammoniumsulfat (NH4)2SO4. Detta utförs genom att tillsätta ökande mängder ammoniumsulfat och samla de olika fraktionerna av fällningsprotein. En fördel med denna metod är att den kan utföras billigt med mycket stora volymer.

de första proteinerna som ska renas är vattenlösliga proteiner. Rening av integrerade membranproteiner kräver störning av cellmembranet för att isolera ett visst protein från andra som finns i samma membranfack. Ibland kan en viss membrandragning isoleras först, såsom att isolera mitokondrier från celler innan man renar ett protein beläget i ett mitokondriellt membran.

ett tvättmedel såsom natriumdodecylsulfat (SDS) kan användas för att lösa upp cellmembran och hålla membranproteiner i lösning under rening; eftersom SDS orsakar denaturering kan emellertid mildare tvättmedel såsom Triton X-100 eller CHAPS användas för att behålla proteinets naturliga konformation under rening.

Metod # 3. Ultracentrifugering:

centrifugering är en process som använder centrifugalkraft för att separera blandningar av partiklar med varierande massor eller densiteter suspenderade i en vätska. När ett kärl (vanligtvis ett rör eller en flaska) som innehåller en blandning av proteiner eller andra partiklar, såsom bakterieceller, roteras med höga hastigheter, ger vinkelmomentet en utåtriktad kraft till varje partikel som är proportionell mot dess massa.

tendensen hos en given partikel att röra sig genom vätskan på grund av denna kraft kompenseras av motståndet som vätskan utövar på partikeln. Nettoeffekten av att” snurra ”provet i en centrifug är att massiva, små och täta partiklar rör sig utåt snabbare än mindre massiva partiklar eller partiklar med mer” drag ” i vätskan.

när suspensioner av partiklar ” spinns ”i en centrifug kan en” pellet ” bildas i botten av kärlet som berikas för de mest massiva partiklarna med lågt drag i vätskan. De återstående, icke-komprimerade partiklarna som fortfarande återstår mestadels i vätskan kallas ”supernatanten” och kan avlägsnas från kärlet för att separera supernatanten från pelleten.

centrifugeringshastigheten specificeras av vinkelaccelerationen som appliceras på provet, vanligtvis mätt i jämförelse med g.om prover centrifugeras tillräckligt länge kommer partiklarna i kärlet att nå jämvikt där partiklarna ackumuleras specifikt vid en punkt i kärlet där deras flytande densitet balanseras med centrifugalkraft. En sådan” jämvikt ” centrifugering kan tillåta omfattande rening av en given partikel.

Sackarosgradientcentrifugering:

en linjär koncentrationsgradient av socker (typiskt sackaros glycerol eller Percoll) genereras i ett rör så att den högsta koncentrationen är på botten och lägst på toppen. Ett proteinprov skiktas sedan ovanpå lutningen och spinns vid höga hastigheter i en ultracentrifuge. Detta får tunga makromolekyler att migrera mot rörets botten snabbare än lättare material.

under centrifugering i frånvaro av sackaros, när partiklar rör sig längre och längre från rotationscentret, upplever de mer och mer centrifugalkraft (ju längre de rör sig desto snabbare rör de sig). Problemet med detta är att det användbara separationsområdet inom kärlet är begränsat till ett litet observerbart fönster.

Spinning ett prov dubbelt så länge betyder inte att partikeln av intresse kommer att gå dubbelt så långt; i själva verket kommer det att gå betydligt längre. Men när proteinerna rör sig genom en sackarosgradient möter de vätska med ökande densitet och viskositet.

en korrekt utformad sackarosgradient kommer att motverka den ökande centrifugalkraften, så partiklarna rör sig i nära proportion till den tid de har varit i centrifugalfältet. Prover separerade med dessa gradienter kallas” betygsätt zonal ” centrifugeringar. Efter separering av proteinet / partiklarna fraktioneras sedan gradienten och samlas upp.

Metod # 4. Kromatografiska metoder:

vanligtvis innehåller ett proteinreningsprotokoll ett eller flera kromatografiska steg. Den grundläggande proceduren i kromatografi är att strömma lösningen innehållande proteinet genom en kolonn fylld med olika material. Olika proteiner interagerar annorlunda med kolonnmaterialet och kan således separeras med den tid som krävs för att passera kolonnen eller de villkor som krävs för att eluera proteinet från kolonnen. Vanligtvis detekteras proteiner när de kommer från kolonnen genom deras absorbans vid 280 nm.

många olika kromatografiska metoder finns:

1. Storlek uteslutning kromatografi:

kromatografi kan användas för att separera protein i lösning eller denatureringsbetingelser med hjälp av porösa geler. Denna teknik är känd som storlek uteslutning kromatografi. Principen är att mindre molekyler måste korsa en större volym i en porös matris. Följaktligen kommer proteiner med ett visst intervall i storlek att kräva en variabel volym eluant (lösningsmedel) innan de samlas i den andra änden av gelkolonnen.

i samband med proteinrening samlas eluanten vanligtvis i olika provrör. Alla provrör som inte innehåller något mätbart spår av proteinet att rena kasseras. Den återstående lösningen är således gjord av proteinet för att rena och alla andra liknande proteiner.

2. Jonbyteskromatografi:

jonbyteskromatografi separerar föreningar beroende på naturen och graden av deras jonladdning. Kolumnen som ska användas väljs utifrån dess typ och laddningsstyrka. Anjonbytarhartser har en positiv laddning och används för att behålla och separera negativt laddade com pounds, medan katjonbytarhartser har en negativ laddning och används för att separera positivt laddade molekyler.

innan separationen börjar pumpas en buffert genom kolonnen för att jämvikta de motsatta laddade jonerna. Vid injektion av provet kommer lösta molekyler att utbyta med buffertjonerna när var och en tävlar om bindningsställena på hartset. Längden på retentionen för varje löst ämne beror på styrkan i laddningen.

de mest svagt laddade föreningarna eluerar först, följt av de med successivt starkare laddningar. På grund av separationsmekanismens natur spelar pH, bufferttyp, buffertkoncentration och temperatur alla viktiga roller för att styra separationen. Jonbyteskromatografi är ett mycket kraftfullt verktyg för användning vid proteinrening och används ofta i både analytiska och preparativa separationer.

3. Affinitetskromatografi:

affinitetskromatografi är en separationsteknik baserad på molekylär konformation, som ofta använder applikationsspecifika hartser. Dessa hartser har ligander fästa vid sina ytor som är specifika för föreningarna som ska separeras. Oftast fungerar dessa ligander på ett sätt som liknar antikropp-antigeninteraktioner. Denna” lås och nyckel ” passar mellan liganden och dess målförening gör den mycket specifik och genererar ofta en enda topp, medan allt annat i provet inte behålls.

många membranproteiner är glykoproteiner och kan renas genom lektinaffinitetskromatografi. Detergent solubiliserade proteiner kan tillåtas binda till ett kromatografiharts som har modifierats för att ha ett kovalent bundet lektin.

proteiner som inte binder till lektinet tvättas bort och sedan specifikt bundna glykoproteiner kan elueras genom att tillsätta en hög koncentration av ett socker som konkurrerar med de bundna glykoproteinerna vid lektinbindningsstället. Vissa lektiner har hög affinitetsbindning till oligosackarider av glykoproteiner som är svåra att konkurrera med sockerarter, och bundna glykoproteiner måste frisättas genom att denaturera lektinet.

4. Metallbindning:

en vanlig teknik innefattar att konstruera en sekvens av 6 till 8 histidiner i proteinets C-terminal. Polyhistidin binder starkt till tvåvärda metalljoner som nickel och kobolt. Proteinet kan passera genom en kolonn innehållande immobiliserade nickeljoner, som binder polyhistidin-taggen. Alla otaggade proteiner passerar genom kolonnen.

proteinet kan elueras med imidazol, som konkurrerar med polyhistidin-taggen för bindning till kolonnen, eller genom en minskning av pH (typiskt till 4,5), vilket minskar affiniteten hos taggen för hartset. Medan denna procedur vanligtvis används för rening av rekombinanta proteiner med en konstruerad affinitetstagg (såsom en 6xHis-tagg eller Clontechs HATTSTAGG), kan den också användas för naturliga proteiner med en inneboende affinitetstordivalenta katjoner.

5. Immunoaffinitetskromatografi:

Immunoaffinitetskromatografi använder den specifika bindningen av en antikropp till målproteinet för att selektivt rena proteinet. Förfarandet innefattar immobilisering av en antikropp till ett kolonnmaterial, som sedan selektivt binder proteinet, medan allt annat flyter igenom. Proteinet kan IX elueras genom att ändra pH eller salthalten. Eftersom denna metod inte involverar teknik i en tagg kan den användas för proteiner från naturliga källor.

6. HPLC:

högpresterande vätskekromatografi eller högtrycksvätskekromatografi är en form av kromatografi som applicerar högt tryck för att driva de lösta ämnena genom kolonnen snabbare. Detta innebär att diffusionen är begränsad och upplösningen förbättras. Den vanligaste formen är” omvänd fas ” HPLC, där kolonnmaterialet är hydrofobt.

proteinerna elueras av en gradient av ökande mängder av ett organiskt lösningsmedel, såsom acetonitril. Proteinerna eluerar enligt deras hydrofobicitet. Efter rening genom HPLC proteinet är i en lösning som endast innehåller flyktiga föreningar, och kan lätt lyofiliseras. HPLC-rening resulterar ofta i denaturering av de renade proteinerna och är således inte tillämpligt på proteiner som inte spontant återföds.