Molekylär detektion av toxigenic C difficile: Toxin A eller B-gen?

Clostridium difficile-infektioner (CDIs) är den främsta orsaken till sjukhusförvärvad diarre, som främst påverkar patienter som utsätts för antibiotika. Infektioner har förknippats med långvariga sjukhusvistelser och betydande sjukvårdskostnader. De senaste förändringarna i epidemiologin för CDI inkluderar ökad incidens och sjukdomens svårighetsgrad, delvis på grund av uppkomsten av (BI/NAP1/027) stam som nu är endemisk i många amerikanska sjukhus.1 kliniker har också observerat ökade infektioner i tidigare lågriskpopulationer och fall av samhällsförvärvad CDI i frånvaro av traditionella riskfaktorer.

endast toxinproducerande C diff-stammar orsakar sjukdom och toxiner A och B (kodade av tcda-och tcdB-generna) verkar spela viktiga roller. Toxinerna är proinflammatoriska enterotoxiner, men toxin B är ett mer potent cytotoxin.2 direkt avföring cytotoxicitet, som detekterar toxin B, var den första kliniskt användbara diagnostiska analysen som utvecklades. I början av 1990-talet utvecklades snabba enzymimmunanalyser (MKB) för att detektera toxin A som är mer immunogent än toxin B. många laboratorier antog dessa analyser eftersom de var praktiska och lättare att använda.

år 2000 var utbrott av svåra fall av CDI på grund av stammar som saknar toxin A (A-B+ varianter) den första ledtråden att toxin A inte var nödvändigt för klinisk sjukdom.3,4 CDI-patienter som hyste dessa variantstammar diagnostiserades fel eftersom deras avföringsprover var negativa av toxin A-specifika MKB.3 i avsaknad av lämplig behandling utvecklade vissa patienter allvarliga CDI-komplikationer med dåliga resultat, inklusive dödsfall.3,4 som svar på uppkomsten av toxin A-negativa variant C diff-stammar utvecklade kit-tillverkare nya MKB-standarder som också upptäckte toxin B eftersom det inte längre var acceptabelt att detektera toxin A ensamt.

majoriteten av sjukdomsframkallande toxigena C diff producerar båda toxinerna. Toxin A-B+ – stammar står emellertid för 2% till 11% av CDI-fallen5 med högre uppskattningar i Irland6 och Asien.7 Dessa stammar, som karakteriseras som stora deletioner i tcda-genen, orsakar samma sjukdomsspektrum som de som producerar båda toxinerna, allt från mild diarre till pseudomembranös kolit.4 vissa rapporter tyder dock på att sjukdom orsakad av toxin A-B+ – stammar är mer sannolikt att vara svår.7

däremot är rapporter om naturligt förekommande sjukdomsframkallande stammar som inte producerar toxin B (toxin A+B-varianter) extremt sällsynta. Den enda rapporten i litteraturen om infektion med en A+B – stam var en patient med återkommande CDI, från vilken C diff-isolat som innehöll både tcda-och tcdB-gener tidigare isolerades.8 avföringsprover från patienten under de tidigare diarrheala episoderna var positiva för toxin B genom en cytotoxicitetsanalys. En undersökning av A + B – stammen från den tredje episoden avslöjade en fullständig frånvaro av tcdb-genen eller andra gener som är nödvändiga för toxinproduktion och en deletion i tcdA-genen.9 vidare misslyckades A + B – varianten med att producera antingen toxin A eller toxin B in vitro, vilket ifrågasatte dess relevans som orsak till patientens symtom.

förmågan att genetiskt konstruera C diff som endast producerar toxin A (A+ B – mutanter) eller toxin B (A-B + mutanter) och infekterar mottagliga hamstrar med mutanterna har lett till två undersökningar om den individuella betydelsen av dessa toxiner i sjukdomsprocessen. I en studie drog författarna slutsatsen att toxin B är viktigt för sjukdom, medan toxin A inte krävs.10 den andra studien visade att antingen toxin kunde orsaka sjukdom, men att de mutanta stammarna som producerar toxin B ensam orsakade allvarligare sjukdom.11 medan de två studierna verkar motsäga varandra, är resultaten från Lyras et al mer förenliga med vad som hittills observerats i klinisk praxis, genom att alla kliniskt relevanta C-diff-stammar (inklusive A+B+ och A-B+ varianter) producerar toxin B och frånvaron av naturligt förekommande sjukdomsframkallande stammar som endast producerar toxin A.

laboratorietestning för detektion av toxigenisk C diff för att bekräfta en CDI-diagnos hos patienter är fortfarande en utmaning på grund av prestanda av vanligt använda toxin A/B EIAs eller en vändningstider för mer känsliga metoder som toxigenisk kultur.12 snabb molekylär testning för toxigenic C diff har signifikant förbättrat noggrannheten med vilken CDI-patienter kan diagnostiseras och hanteras. Med tillförlitliga känsligheter och specificiteter för toxigenisk kultur kan kliniker lita på laboratorieresultat som bekräftar deras kliniska misstanke om CDI eller utesluta C diff som källa en patients symtom. Enligt de nya Shea / IDSA (Society for Healthcare Epidemiology of America och Infectious Diseases Society of America) riktlinjer för klinisk praxis för CDI hos vuxna verkar PCR-testning vara snabb, känslig och specifik och kan i slutändan ta itu med testproblem.12

alla FDA-rensade realtidspolymeraskedjereaktion, eller PCR, analyser riktar sig mot toxin B-genen (tcdB). Valet av tcdb som ett molekylärt mål är idealiskt av flera skäl: toxins väsentliga roll i sjukdomsprocessen10,11; närvaron av toxin B och tcdB i alla sjukdomsproducerande stammar; och bevis för att detektion av tcdB hos symtomatiska patienter korrelerar väl med korrekt diagnos av CDI.13

motiveringen för andra mål som tcda-genen är mindre tydlig. Många A-B+ variant C diff-stammar har deletioner i toxin A-gene14 och kanske inte är tillförlitliga som mål. Till skillnad från tcdb-genen saknas studier som visar att detektion av tcdA korrelerar med klinisk sjukdom; och eftersom genen också kan hittas ensam i icke-sjukdomsframkallande stammar, kan 15 detektion av tcdA potentiellt leda till feldiagnos av CDI.

CDI-diagnos kräver en kombination av kliniska symtom och noggrann detektering av toxigenisk C diff i en symtomatisk patients avföring.12 när de används på lämpligt sätt och begränsas till patienter med symtom som överensstämmer med klinisk sjukdom, kan PCR-analyser som riktar sig mot tcdb-genen underlätta korrekt diagnos av CDI vilket i sin tur kan leda till bättre patienthantering med lämplig terapi och snabbt genomförande av infektionskontrollåtgärder.

Diane Kawa, PhD, SM(ASCP),
är direktör för vetenskapliga frågor vid BD i Franklin Lakes, NJ.