abstrakt
influensavirus neuraminidas (NA) spelar en viktig roll vid frisättning och spridning av avkomman virioner, efter den intracellulära virusreplikationscykeln. För att testa om NA också kunde underlätta virusinträde i cellen infekterade vi kulturer av humant luftvägsepitel med humana och aviära influensavirus i närvaro av NA-hämmaren oseltamivirkarboxylat. Tjugo till 500 gånger mindre celler infekterades i läkemedelsbehandlade kontra icke-behandlade kulturer (P < 0,0001) 7 timmar efter virusapplikation, vilket indikerar att läkemedlet undertryckte initieringen av infektion. Dessa data visar att viral NA spelar en roll tidigt i infektionen, och de ger ytterligare skäl för profylaktisk användning av NA-hämmare.
man tror att den huvudsakliga funktionen av viral neuraminidas (NA) är i slutskedet av infektion när NA klyver sialinsyra från cellytan och avkomma virioner underlättar virusfrisättning från infekterade celler (1, 2). Mindre är känt om NA-funktioner under virusinträde i cellen. Det har länge antagits att NA främjar virustillträde till målceller i luftvägarna genom slemnedbrytning (3). Detta koncept har emellertid aldrig formellt bevisats på grund av bristen på ett adekvat experimentellt system. Dessutom har vissa bevis som argumenterar mot NA: s roll i de tidiga infektionsstadierna rapporterats (granskas i referens 2).
för att ta itu med denna fråga studerade vi effekterna av NA-hämmaren oseltamivirkarboxylat (oc) (9) på influensavirusinträde i kulturer av humant luftvägsepitel. Primära humana trakeobronchiala epitelceller (HTBE; Klonetik) och primära nasala epitelceller (PromoCell GmbH) odlades på membranstöd (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) vid luft-vätskegränssnittet i serumfri tillväxtfaktor och hormon-kompletterat medium (6, 8). Helt differentierade 4-till 8 veckor gamla kulturer användes för alla experiment. Dessa kulturer var pseudostratifierade och polariserade; innehöll basala, cilierade och slemutsöndrande celler; och liknade nära humant luftvägsepitel in vivo (Fig. 1). OC (1 oc, om inte annat anges) tillsattes till virussuspensioner och till basolaterala fack i kulturerna strax innan de infekterade två replikatkulturer från den apikala sidan. Två kontrollkulturer infekterades i frånvaro av hämmare. En timme efter infektion tog vi bort virusinokulatet och inkuberade kulturer vid luft-vätskegränssnittet för ytterligare 6 timmar för att möjliggöra intracellulär virusreplikation. Kulturerna fixerades sedan och infekterade celler identifierades genom färgning med polyklonal antisera till hela virus följt av motsvarande peroxidasmärkta sekundära antikroppar (Dianova) och aminoetylkarbazolsubstrat (Sigma). Positiv färgning indikerade framgångsrik virusinmatning i cellen. Kulturerna analyserades en ansikte vid en förstoring av 200 (Olympus IMT-2). Ett totalt antal celler som uttryckte viralt antigen räknades i epitelsegmentet som inkluderade alla på varandra följande mikroskopiska vyer (0,28 med 0,42 mm) längs kulturens diameter (segmentyta, 3 mm2; antal celler per segment, cirka 30 000). Fyra segment per kultur räknades genom att rotera kulturen medurs med 45o. data för åtta segment av två replikatkulturer var i genomsnitt.
i två experiment med htbe – kulturer infekterade det humana viruset A/Memphis/14/96 (H1N1) 22-och 65-faldigt färre celler i närvaro av NA-hämmare jämfört med kontroller (Fig. 2; Tabell 1) (P < 0,0001). Virus A/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) från en vild vattenfågel och a/Turkey/Italy/2379/99 (H7N1) från tamfjäderfä var också markant känsliga för OC i dessa kulturer. I nasala epitelkulturer minskade oc humant och Anka virusinfektion 120-respektive 520-faldigt. Dessa resultat indikerade att hämning av viral NA undertrycker initieringen av virusinfektion.
A/Chicken/Germany/R28 / 03 (H7N7) tillhör den högpatogena fågelinfluensaviruslinjen som orsakade utbrott av fågelpest i kommersiella fjäderfägårdar i Nederländerna, Belgien och Tyskland 2003. Dessa virus överfördes till minst 89 människor, varav de flesta presenterades med konjunktivit, men ett dödligt fall av lunginflammation inträffade också (5). H7N7-kycklingvirusinfektionen i HTBE-kulturer minskade 140 – och 40-faldigt i närvaro av 1 respektive 0,1 oc / m OC. Dessa koncentrationer representerade typiska plasmakoncentrationer av högsta och lägsta läkemedel som uppnåtts hos människor efter administrering av 75 mg oseltamivirfosfat, den rekommenderade dosen för profylax (9).
för att bekräfta hypotesen att infektionshämning i våra experiment var direkt relaterad till inhiberingen av viral na-enzymatisk aktivitet, använde vi human a / Sydney/5/97-liksom virus (H3N2) och dess oseltamivirresistenta mutant med en r292k-substitution i NA, vilket gör NA 9000 gånger mindre känslig för hämning av OC (4). I överensstämmelse med hypotesen hämmades det överordnade humana viruset starkt av OC, medan endast en marginell nivå av inhibering av den resistenta mutanten observerades när båda virusen testades i samma experiment i HTBE-kulturer (Tabell 1). Hittills har ingen adekvat cellodlingsanalys varit tillgänglig för övervakning av influensavirusresistens mot NA-hämmare på grund av missanpassningen mellan sialinsyrareceptorer hos människor och i konventionella laboratoriecellinjer (9, 11). Våra resultat tyder på att differentierade kulturer av humant luftvägsepitel kan vara ett lämpligt cellodlingssystem för detektering av influensavirusresistens mot NA-hämmare.
slutligen, med användning av läkemedelskänsliga a / Sydney/5/97-liksom virus testade vi infektionshämning av OC tillsatt vid olika tidpunkter efter virusinokulering. Medan 47-faldigt färre celler infekterades när läkemedlet tillsattes strax före infektionen, resulterade en 1-timmars fördröjning utöver OC i endast 1, 5-faldig hämning med avseende på den icke-behandlade kontrollen (Tabell 1). Om läkemedlet tillsattes 4 h efter virusinokulering observerades ingen statistiskt signifikant inhibering. Dessa data antydde att OC påverkade de tidigaste infektionsstadierna före virusreplikation.
Sammanfattningsvis har vi för första gången tillhandahållit direkta experimentella bevis för NA: s väsentliga roll vid virusinvasionen av det cilierade epitelet i mänskliga luftvägar. NA-funktionen i detta skede är troligtvis avlägsnande av lockreceptorer på muciner, cilia och cellulär glycocalix, stark bindning till var och en skulle hindra virusåtkomst till funktionella receptorer på ytmembranet i målceller. Men andra NA-funktioner-till exempel främjande av hemagglutininmedierad fusion (7)—kan inte uteslutas, och ytterligare studier behövs för att specificera de exakta mekanismerna genom vilka NA främjar virusinträde i luftvägsepitelceller.
med inget vaccin tillgängligt ännu mot högpatogena H7N7-och H5N1-aviära influensavirus är antivirala läkemedel det enda alternativet för att bekämpa fågelinfluensa (10). Jämfört med andra anti-influensamedel tolereras NA-hämmarna väl och är effektiva mot alla stammar av influensa A-och B-virus. Det har varit lite bevis på uppkomsten av virusresistens, och smittsamheten hos mutanta virus äventyras vanligtvis (9, 11). Na-hämmarnas förmåga att undertrycka infektion före virusinträde i celler understryker deras höga potential för förebyggande åtgärder. I synnerhet ger våra data den vetenskapliga grunden för att stödja den profylaktiska användningen av dessa föreningar för personer med hög risk för infektion med aviära influensavirus.
