kort introduktion: Blotting tekniker
Blotting används i molekylärbiologi för identifiering av proteiner och nukleinsyror och används ofta för diagnostiska ändamål. Denna teknik immobiliserar molekylen av intresse på ett stöd, vilket är ett nitrocellulosiskt membran eller nylon. Den använder hybridiseringstekniker för identifiering av de specifika nukleinsyrorna och generna.
blottingtekniken är ett verktyg som används vid identifiering av biomolekyler såsom ad-DNA, mRNA och protein under olika stadier av genuttryck. Proteinsyntes involverar uttryck av ett DNA-segment som omvandlas till mRNA för att producera respektive protein.
subtyper av blotting som norra, västra & södra beror på målmolekylen som söks. När en DNA-sekvens är grunden eller koden för en proteinmolekyl kan den specifika DNA-molekylen av intresse blottas med hjälp av Southern Blotting-teknik. Under genuttryck, när DNA uttrycks som mRNA för en proteinproduktion, kan denna process identifieras genom nordlig blotting. Slutligen producerar det kodade mRNA det berörda proteinet, denna proteinidentifiering kan göras genom Western Blotting.
allmänt förfarande för blotting
- homogenisera provet.
- Separation av molekylen av intresse genom ett elektroforemembran.
- överföra molekylerna till ett nitro cellulosamembran/ nylonmembran.
- hybridisering eller identifiering av molekylen
Northern Blotting
Northern Blotting är en teknik som används för studier av genuttryck. Det görs genom detektion av särskilt RNA (eller isolerat mRNA). mRNA representeras i allmänhet som 5% av den totala RNA-sekvensen. Denna metod avslöjar identiteten, antalet, aktiviteten och storleken på den specifika genen. Denna blottningsteknik kan också användas för tillväxt av en vävnad eller organism. I olika stadier av differentiering och morfogenes förändras överflödet av ett RNA och detta kan identifieras med hjälp av denna teknik. Det hjälper också till att identifiera onormalt, sjukt eller infekterat tillstånd på molekylär nivå. Northern blot-tekniken utvecklades 1977 av James Alwine, David Kemp och George Stank vid Stanford University. Tekniken fick sitt namn på grund av likheten i processen med Southern blotting. Den primära skillnaden mellan dessa två tekniker är att northern blotting endast berör RNA.
princip
som all normal blotting-teknik börjar northern blotting med elektrofores för att separera RNA-prover efter storlek. Elektrofores separerar RNA-molekylerna baserat på laddningen av nukleinsyrorna. Laddningen i nukleinsyrorna är proportionell mot storleken på nukleinsyrasekvensen. Således separerar elektroforemembranet Nukleinsyrasekvensen enligt storleken på RNA-sekvensen. I fall där vår målsekvens är ett mRNA kan provet isoleras genom oligocellulosakromatografiska tekniker, eftersom mRNA kännetecknas av poly(A)-svansen. Eftersom gelmolekyler är bräckliga i naturen överförs de separerade sekvenserna till nylonmembranen. Valet av nylonmembran bidrar till den faktor som nukleinsyror är negativt laddade i naturen. När RNA-molekylerna har överförts immobiliseras den genom kovalent koppling. Sonden tillsätts sedan, sonden kan komplettera en ss-DNA-sekvens. Formamid används vanligtvis som en blottningsbuffert eftersom den minskar glödgningstemperaturen.
förfarande
- det insamlade vävnads-eller odlingsprovet homogeniseras först. Proverna kan vara representativa för olika typer av kultur för jämförelse eller det kan vara för studier av olika tillväxtstadier inom kulturen.
- RNA-sekvensen separeras i elektroforesenheten en agarosgel används för syftet med nukleinsyraseparationen.
- nu överförs den separerade RNA-sekvensen till nylonmembranet. Detta görs genom två mekanismer kapillärverkan och den joniska interaktionen.
- överföringen görs genom att hålla gelen i följande ordning. Först placeras agarosgelen på botten av stapeln, följt av blottningsmembranet. På toppen av dessa pappershanddukar placeras en mild vikt (glasplatta). Hela installationen hålls i en bägare som innehåller överföringsbuffert.
- RNA som överförs till nylonmembranet fixeras sedan med UV-strålning.
- det fasta nylonmembranet blandas sedan med sonder. Sonderna är speciellt utformade för genen av intresse, så att de kommer att hybridisera med RNA-sekvenser på fläcken som motsvarar sekvensen av intresse.
- blotmembranet tvättas för att avlägsna oönskad sond
- märkt sond detekteras genom kemiluminescens eller autoradiografi. Resultatet blir mörka band i röntgenfilm.
GEl och prober
RNA-proverna separeras med användning av agarosgeler med användning av formaldehyd som denatureringsmedel men i små RNA-eller mikro-RNA-sekvenser kan polyakrylamid-sekvenser med urea som denatureringsmedel också användas. Etidiumbromid kan användas som färgningsmedel. Två typer av markörer är för storleksmarkering. En RNA-stege och ribosomal subenhet används för identifiering av storleken på RNA-sekvenserna.
prober kan komplettera hela eller delar av RNA av intresse. De kan vara RNA, DNA eller oligonukleotider med 25 komplementära baspar till mål-RNA. Vid RNA-sonder används invitro-producerade sonder eftersom invivo-sonder kan denaturera på grund av den rigorösa tvätten. Vid cDNA märks sonderna med radioaktiva isotoper, alkaliskt fosfatas eller pepparrotperoxidas vid kemiluminescens.
