Onkologirapporter

introduktion

även om nya terapier nyligen har introducerats i klinisk praxis för behandling av avancerad prostatcancer, prostatacancer har förblivit den näst dödligaste cancer hos män i USA 2014 (1). Nya terapeutiska mål och strategierär brådskande nödvändiga för att ytterligare förbättra det kliniska resultatet avpatienter med prostatacancer.

ett lovande potentiellt terapeutiskt mål ärcyklinberoende Kinas 5 (CDK5). CDK5 är en serin/treonin kinasestrukturellt liknar andra CDK (2). CDK5 verkar inte ha en majorroll i cellcykelreglering (3,4). Denhar varit väl karakteriserad för sin dominerande roll iutveckling av centrala nervsystemet, inklusive Roller ineuronal migration, differentiering och vidhäftning (5,6). Vioch andra visade därefter att CDK5 spelar en viktig roll icancerutveckling och metastasering (7-12). Inprostatacancerceller visade vi att CDK5 var kritisk forcytoskeletal integritet, cellmigration och invasion, och invivo, för metastas (7). Inpankreatisk cancer, CDK5 är inneboende för KRAS-signalering genom den centrala viktiga RAL-signaltransduktionsvägen, vilket ger ett potentiellt ’drogbart’ mål för mutanta kras-tumörer (8). Tillsammans indikerar dessa studier attinhibition av CDK5, ensam eller i kombination med andra medel, kanGe en effektiv terapeutisk strategi för dessa och andracancertyper.

i den aktuella studien satte vi oss för att identifiera medel som skulle vara särskilt effektiva i kombination med CDK5inhibition i prostatacancerceller. Därför utförde vi ascreen av Johns Hopkins Drug Library (JHDL). JHDL är en samling av 3,360 farmaceutiska föreningar som framgångsrikt har slutfört säkerhetstestning hos människor för en mängd olika tillämpningar(13,14). Detta bibliotek har använts framgångsrikt för att återanvända föreningar för cancerterapi,inklusive identifiering av digoxin som en HIF1a-hämmare (15) och itrakonazol som en angiogenesinhibitor (16). Vi arbetade tidigare JHDL för att identifiera cetrimoniumbromid och irinotekan somföreningar med ökad antitumöraktivitet mot prostatacancerceller som uttrycker låga nivåer av metastasisuppressorgenen N-mycdownreglerad Gen 1 (NDRG1) (17).Här utförde vi en liknande jhdl-screening med prostatacancerceller som skiljer sig åt i CDK5-aktivitet. Tiloron identifierades som enförening med in vitro syntetisk dödlighet inCDK5-bristfälliga prostatacancerceller.

material och metoder

cellodling

PC3 prostatacancercellinjer erhölls frånatcc. Dessa celler härrör från en benmetastas från en 62-årig prostatacancerpatient. Mänskliga prostata fibroblaster, snällttillhandahålls av Dr J. Isaacs, erhölls från en prostatabiopsi på A62-årig prostatacancerpatient med en Gleason-poäng på 4. Bothcell linjer odlades och underhålls I rpmi-1640 (Invitrogen)media kompletterat med 10% fetalt bovint serum. Cellerna odladesi en fuktad inkubator vid 37 C i en 5% Co2atmosfär.

skapande av PC3 CDK5dn-cellinjen

förlust av CDK5-funktion uppnåddes i PC3-celler genom transfektion av en dominerande negativ konstruktion innehållande en D144Nmutation, vänligt tillhandahållen av Dr L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Det använda protokollet har beskrivits tidigare (7). I korthet subklonerades konstruktionen i en dubbelriktad Tet-vektor, pBI-EGFP (BD Biosciences), som hade en zeocin-resistensgen tillsatt förval (vänligt tillhandahållen av Dr K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School of Medicine). PBI-EGFP Tom vektor eller PBI-EGFPCDK5dn vektor transfekterades till PC3-celler som innehöll atet-Off promotorkonstruktion, pTTa (BD Biosciences).

Western blotting

Western blotting utfördes som beskrivettidigare (19). Tio mikrogram avprotein laddades på gelen. Primära antikroppar löstes iblockeringsbuffert . En 1:1000 utspädning användes för anti – CDK5 (Sigma-Aldrich); Anti-vinculin (Millipore,Upstate) späddes 1: 4000. Sekundära antikroppar späddes ata 1: 4 000 utspädning. Normalisering av bandintensiteten utfördesut med hushållersproteinet vinculin. Utvecklade blottar varskannas med hjälp av en Microtek-skanner.

Sårläkningsanalys

Sårläkningsanalyser utfördes med confluentPC3-kontroll (innehållande den tomma PBI-EGFP-vektorn) eller PC3 CDK5dncells. En gummitippad skrapa användes för att skrapa bort ett område avceller. Ljus mikroskopiska bilder fångades omedelbart och 24 hafter skrapning.

liten molekylbibliotek screening

jhdl-biblioteket har beskrivits tidigare(13,14,17).Lagring och screening av jhdl-föreningar utfördes sombeskrivet tidigare (17).I korthet såddes PC3-kontroll-och CDK5dn-celler i 96-brunnsplattor(1 msk 103 celler/brunn) och fick klibba över natten. Därefter tillsattes 5 oktyl av läkemedel, lagrade som lagerlösningar på 200 oktylm inDMSO/H2O, för att slutföra rpmi-media, så att celler behandlades i en slutlig koncentration av 10 oktylm. Efter 48 h avbehandling tillsattes 20 occyl MTS-reagens från CellTiter 96 occur AqueousNon-radioaktiv Cellproliferationsanalys till varjebrunn under en varaktighet av 2-4 h vid 37 occur C. Plattor analyserades med användning av asoftmax Pro plate reader (molekylära enheter). Proliferation avbehandlade celler jämfördes med proliferation av DMSO-behandlade PC3control-eller CDK5dn-celler (proliferationsindex). Proliferationsindices av PC3 CDK5dn-celler jämfördes med proliferationindices av PC3-kontrollceller. En PubMed-studie utfördes för attbedöma den kliniska användningen av potentiella träffar.

MTS-analyser

MTS-analyser utfördes för att mäta denantiproliferativa effekten av tiloronbehandling. Tiloronedihydroklorid (Sigma-Aldrich) lagrades som en 10 mM stocksolution i DMSO vid -20 C. Ett tusen PC3-celler var pläterade i96-brunnsplattor innehållande 100 occl komplett RPMI-media. Vid cirka 50% sammanflöde administrerades tilorondihydroklorid. Forexperiment föreningen späddes i fullständig RPMI media toobtain den önskade slutliga koncentrationen. Efter behandling för 72 h(Tiloron monoterapi) tillsattes MTS-reagens och absorption vid490 nm bestämdes med användning av en SoftMax Pro-plattläsare.Proliferationsindex beräknades; obehandlade PC3-kontroll-orCDK5dn-celler (i 103 fullständiga rpmi-medier) användes som acontrol. Studentens t-test utfördes för att bedöma p-värden.

Klonogena analyser

Klonogena analyser utfördes för att bedöma långsiktig överlevnad efter tiloronbehandling. Prostatacancerceller varplattade i 60 mm rätter och fick klibba. Vid 50-60% sammanflöde behandlades celler med Tiloron i 72 h. därefter pläterades 1 103-celler från varje skål i tre exemplar i60-mm-rätter och inkuberades i fullständiga RPMI-media i 12-dagar.Kolonier fixerades och färgades med en lösning innehållande 90% metanol och 10% kristallviolett lösning (2,3% kristallviolett, 0,1% ammoniumoxalat och 20% etylalkohol; Sigma). Kolonier varskannas med en datorscanner (Microtek) och räknas manuellt.Studentens t-test utfördes för att utvärdera om skillnadermellan cellinjer var statistiskt signifikanta.

3D-Tillväxtanalys

3D-tillväxtanalyser utfördes med användning av sameprotocol som beskrivits tidigare (17). Kort sagt, sfäroider genererades avodling av PC3-celler för 16 h som en hängande droppe över en fuktad platta i en CO2-inkubator i komplett rpmi-mediainnehållande 0,5% metylcellulosa. Sfäroider var inbäddade ikollagenmatris (BD Biosciences), behandlades med Tiloron och avbildades med ett Nikon Eclipse Ti-mikroskop (Nikon) på behandlingsdagen och sex dagar efter behandlingsstart. Sfäroid och total (spheroidplus groddar) områden mättes med ImageJ. Foldökningar beräknades genom att dividera sfäroid/total yta på dag 6 medsferoid / total yta på dag 0 för varje enskild sfäroid. För varjecell linje och tidpunkt, vik ökningar av fyra sfäroider wereaveraged. Statistiska analyser utfördes med hjälp av Student ’ St-tester.

resultat

undertryckande av CDK5-aktivitet

PC3 prostatacancerceller valdes för jhdlcompound-skärmen på grund av deras mycket metastatiska potential och androgenoberoende, vilket liknar aggressiv metastatiskcastratresistent prostatacancer. CDK5-aktivitet hämmades avtransfektion och urval av en dominerande negativ mutation (CDK5144N). Dessa PC3 CDK5dn-celler hade en högre proteinnivå av totalCDK5 jämfört med PC3-kontrollcellerna (PC3-celler transfekterade med en tom vektor) (Fig. 1A). Awound healing assay (8) bekräftadeatt CDK5 var funktionellt inaktiv i dessa celler; till skillnad från PC3control-cellerna hade PC3 CDK5dn-celler inte förmågan att invadera den skrapade ytan (Fig.1B).

Biblioteksskärm för föreningar som riktar sig tillpc3-celler baserade på CDK5-aktivitet

en screeningsanalys med hög genomströmning utfördes för att välja föreningar som riktar sig mot PC3-celler baserat på CDK5-aktivitet. PC3control-och CDK5dn-celler behandlades med alla föreningar avjhdl vid 10 occurm för 48 h. För att identifiera träffar som selektivt targetPC3-celler baserat på CDK5-uttryck valde vi alla föreningar ivilket proliferationsindexförhållandet (CDK5dn/control) var under 0,5 eller över 1,5 (Fig. 2A).Dessutom måste träffar hämma cellproliferation av PC3-celler medminst 10%, Eftersom vi var specifikt intresserade av föreningar somhämmade celltillväxt (horisontell och vertikal linje i graf). Vi valde också alla föreningar som hämmade cellproliferation inPC3-celler med 70% (nedre vänstra hörnet av diagrammet), eftersom vi var intresserade av att identifiera potentiella högeffektiva antitumörmedel. Totalt valdes 41 träffar för vidare utvärdering.

en sekundär skärm utfördes där selectedhits från den primära skärmen tillsattes vid 10 occurm för 48 h till PC3control och CDK5dn celler i tre exemplar, att sålla ut falska positiveresults (Fig. 2B). Cutoff värdenvar något mindre stränga än i den primära skärmen; föreningarbetraktades som en träff när förhållandet mellan proliferationsindex(CDK5dn/control) var under 0,7 eller över 1,4. Detta resulterade iidentifiering av tre föreningar som selektivt targetCDK5-Uttryckande PC3-celler: rutilantin, etakridinlaktat ochcetalkoniumklorid (Fig. 2C).Dessa föreningar har inte använts som antitumörmedel och deraspotential klinisk användning som intravenösa antitumörmedel verkarbegränsad (20-23). En annan förening, Tiloron analogR9536-DA, var mycket effektiv för att hämma båda isogena PC3-cellinjer (> 70% hämning), men det hämmade proliferation av PC3CDK5dn-celler något mer effektivt (förhållande CDK5dn/kontroll:0.687). Tiloron och dess analoger har antiviral aktivitet, verkar åtminstone delvis som interferoninducerare (24-26) och har visats prekliniskt och kliniskt ha antitumöraktivitet också (27,28).

Tiloron riktar sig selektivt mot PC3-celler med låg CDK5-aktivitet

vi fortsatte våra experiment med nyupplöst tilorondihydroklorid. Efter 72 h tiloronbehandling vidolika koncentrationer, dess IC50 etablerades vid 8-12 occurm i PC3 CDK5dn-celler och 15 occurm i PC3-kontrollceller i MTS-analyser(Fig. 3A). Vid 8 occurm minskade proliferationsaktiviteten med 24 respektive 47% i PC3-kontrollen respektive CDK5dncells (p=0,001). För att bedöma toxiciteten hos Tiloron inormala prostataceller utfördes MTS-analyser med tiloronbehandling av humana prostatafibroblaster (Fig. 3B). Känsligheten hos dessa celler totiloron liknade den hos PC3-kontrollcellerna.

den hämmande effekten av Tiloron i PC3-celler utvärderades vidare genom att utföra klonogena analyser (Fig. 3C). PC3 CDK5dn-celler var också betydligt känsligare än PC3-kontrollceller för Tiloron i denna analys. Behandling med 10 occurm Tiloron resulterade i klonogenöverlevnad av 40% i PC3 CDK5dn-celler och 72% i PC3-kontrollceller(p=0,002).

en sfäroidtillväxtanalys utfördes för att bedöma 3dtumörtillväxt och invasion av PC3-celler vid tiloronbehandling(Fig. 4). Både PC3-kontroll och PC3CDK5dn-celler hade jämförbara ökningar i sfäroidstorlek över sex dagar. Den totala storleken (storleken på sfäroider plus groddar) hade emellertid en högre vikningsökning i PC3-kontrollceller, vilket bekräftar att obehandlade PC3 CDK5dn-celler hade en minskad invasiv potential somjämfört med PC3-kontrollceller. När Tiloron administrerades vid 5 occurm hade PC3 – kontrollsfärer en liknande tillväxt och invasiva mönstersom de obehandlade PC3-kontrollcellerna (p=0,59) (Fig. 4B, vänster graf). Närentiloron administrerades i samma koncentration till PC3 Cdk5dnceller observerades emellertid en signifikant minskning av både sfäroidstorlek och totalstorlekobserverades (p<0,01), vilket tyder på att Tiloron framgångsriktinhibits sfäroidtillväxt och invasion av PC3 CDK5dn-celler näradministreras vid 5 occurm (Fig. 4B, höger graf). Vid 10 occurm hade båda isogena cellinjerna en minskadinvasiv potential.

diskussion

JHDL, ett bibliotek med väl karakteriseradefarmaceutiska föreningar, utvecklades för att underlätta läkemedelsökningsstudier (29). Den Omfattande in vivo-toxiciteten och farmakokinetiska profiler av föreningar i biblioteket möjliggör snabb efterföljande utveckling av dessa föreningar. Flera föreningar från JHDL har avancerats till kliniska prövningar för cancer och andra terapeutiska tillämpningar(13,14,16,17,30–32).

i den aktuella studien screenade vi JHDL-föreningarna som differentiellt hämmar cancercellstillväxten i närvaro av CDK5-hämning; Tiloron och en tiloronanalog varidentifieras som medel som selektivt riktar sig mot CDK5-bristfälliga Pc3prostatacancerceller. Tilorone (Amixin IC) används kliniskti vissa länder som ett oralt aktivt antiviralt medel (25). Tiloron har testats på människorFör behandling av cerebrala gliom, laryngeal papillomatos ochbröstcancer (28,33,34).Även om antitumöreffektivitet rapporterades har intresset för Tiloron förcancerbehandling minskat. Nyligen rapporterade Zhou et alnya tiloronanaloger med förbättrad anticanceraktivitet (35). Dessa analoger kan vara lovande attundersökning, särskilt i kombination med CDK5-hämning.

förutom möjligheten att Tiloron kan vara lovande i kombination med CDK5-hämning, tyder identifieringen av Tiloron som ett medel som selektivt riktar sig mot celler inom aktiv CDK5 på potentiella klasser av läkemedel för att förstärka effekten av CDK5-hämning. Tiloron har karakteriserats som aninterferoninducerare (24). Detta föreslår att interferon i sig, eller en alternativ interferoninduktor, såsom en TLR-agonist, kan vara användbar i kombination med aCDK5-hämmare. Ändå kan andra mekanismer vara inblandade. Till exempel är Tiloron också ett DNA-interkalerande medel (24) och man kan föreställa sig att det kanmodulera kromatinstruktur och genuttryck. Andra funktioner av Tiloron, inklusive signalväg och transkriptionsfaktorinteraktioner (36,37), kan också vara inblandade. Ytterligare studierbehövs för att riva upp den exakta verkningsmekanismen genom vilkentiloron riktar sig selektivt mot CDK5-negativa prostatacancerceller.

bekräftelser

författarna vill tacka professorerna P. J. Van Diestand E. Van der Wall för deras stöd och diskussion och ProfessorsM.A. Carducci och J. T. Isaacs för deras tillhandahållande av laboratoriematerial. Denna studie stöddes av Flight Attendant MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 och NCI Sports bevilja P50 CA58236. M. D. W. stöds av Dr Saal van Zwanenbergstichting och HuygensScholarship-programmet.