PMC

1Detailed protokoll och felsökningstips för alla aspekter av GST gen fusion protein expression system finns tillgängliga från GE Healthcare i handböckerna: GST Gen Fusion System, produktnummer 18-1157-58, och handboken för rekombinant Protein, produktnummer 18-1142-75. Handböckerna finns att köpa i papperskopia eller kan nås som PDF på GE Healthcare-webbplatsen.

2användningen av JM105 eller en liknande stam rekommenderas för kloning och underhåll av vektorn. Stammar av BL21 och dess derivat, eller en annan proteasbristande stam, rekommenderas för maximalt proteinuttryck. Stammar som är bristfälliga i cytoplasmatiska proteasgenprodukter såsom lon, ompT, degP eller htpR kan minimera effekterna av proteolytisk nedbrytning av överuttryckt protein av värden. Använd inte en stam av E. coli som bär rec1A-allelen för att sprida pGEX-plasmider, eftersom deletioner eller omarrangemang av plasmid-DNA har rapporterats.

3glutation Sepharose 4B massmedia används i detta reningsprotokoll. Detta kromatografimedium är idealiskt för screeningförhållanden och möjliggör enkel uppskalning. Reningar utförs enkelt med antingen gravitationsflöde eller ett lågtryckskromatografisystem, eller kan användas i batchreningar baserade på centrifugering. Gstrap FF affinity kolumner är 1 ml eller 5 ml färdigförpackade kolumner som också är tillgängliga och kan anslutas i serie för uppskalning. Dessa kolumner är för användning med ett vätskekromatografiskt system, en pump eller spruta. Förutom dessa format är glutation Sepharose också tillgängligt i spin-kolumner och 96-brunnsplattaformat för snabb screening av GST-fusionsproteinuttryck och reningsförhållanden.

4DFP är ett extremt farligt neurotoxin. Följ de försiktighetsåtgärder som tillhandahålls av tillverkaren och hantera endast det snygga reagenset i en kemisk rökhuv.

5tillägg av proteashämmare till lysbufferten hjälper till att förhindra proteolytisk nedbrytning av målproteinet under extraktion. Den exakta cocktailen av proteashämmare som tillsätts lysbufferten bör emellertid anpassas till målproteinets egenskaper. Reduktionsmedel som 2-ME, DTT eller TCEP vid koncentrationer av 1-10 mM bör läggas till bufferten efter behov. Tillsats av ett nonjoniskt tvättmedel, såsom 1% Triton X-100, kan också tillsättas till bufferten för att hjälpa till vid extraktion.

6Following är ett screeningprotokoll för att kontrollera proteinuttrycksnivåer av fusionsprotein i minikulturer. Närvaron av en ökning av proteinnivåer vid den förväntade molekylvikten på en SDS-PAGE gel efter induktion med IPTG är en bra indikation på framgångsrikt proteinuttryck. Efter induktion bör ett framträdande band vid förväntad molekylvikt (molekylvikt av målprotein + ~ 26 KDa för GST-delen) vara synlig. Om man misstänker att proteinet uttrycks på en låg nivå kan verifiering av korrekt uttryck åstadkommas med hjälp av Western blotting med en antikropp som är specifik för antingen målproteinet eller GST. Om proverna inte omedelbart kommer att analyseras av SDS-sida, kan de lagras över natten vid 4 C eller vid -20 C för längre lagring.

1. inokulera flera isolerade kolonier i separata 50 ml centrifugrör innehållande 10 ml LB kompletterat med 100 USC/ml ampicillin. Odla en övernattningskultur vid 37 kcal C med skakning.

2. nästa morgon, tillsätt 0,5 ml över natten kultur till 4,5 ml LB med 100 occurg/ml ampicillin. Väx 1 h vid 37 kcal C.

3. ta bort 1 ml un-inducerat prov. Centrifugera och ta bort supernatanten. Frysa eller lagra på is tills redo att köra SDS-sida.

4. tillsätt IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM och växa i ytterligare 2-3 timmar.

5. ta bort 1 ml inducerat prov. Centrifugera och ta bort supernatanten. Frysa eller lagra på is tills redo att köra SDS-sida.

6. Resuspendera cellpellets i 200 occyls SDS-sida provbuffert; värme 3-5 min vid 90 oc C.

7. analysera 5-10 securil använda SDS-sida följt av Coomassie blå färgning (eller 1-2 securil för Western blot).

7prover som odlas i minikulturer kan också användas för att utvärdera lösligheten hos ett visst fusionsprotein (Se anmärkning 6 för mini-culture expression protocol). Vid slutet av induktionsperioden, skörda cellerna genom centrifugering. Återsuspendera pelleten i 200 occyl av kalla PBS. Lyse cellerna med ultraljudsbehandling; hålla provet på is. Spara en liten alikvot av lysatet för analys av SDS-sida. Centrifugera det lyserade provet i 15 minuter. Ta bort supernatanten till ett separat rör. Återsuspendera pelleten i 200 occoll PBS. Analysera en del av det råa lysatet, supernatanten och den resuspenderade pelleten genom SDS-PAGE eller Western blotting. Om provet observeras i både lysat-och supernatantfraktionen är provet tillräckligt lösligt. Om provet är närvarande främst i lysatet och resuspenderad pellet, är provet troligen i ocklusionskroppar. I fall där proteinet finns i inklusionskroppar, utforska olika uttrycksförhållanden för att flytta uttryck till en löslig form (Se anmärkning 8).

8OM fusionsproteinet främst uttrycks i inklusionskroppar (t. ex. > 80% olöslig) kan olika strategier användas för att förbättra lösligheten. Ofta är induktion vid lägre temperatur (15-25 kcal C) effektiv vid förskjutning av uttryck från inklusionskroppar till den lösliga fraktionen. Celler som induceras vid denna lägre temperatur kommer att växa långsammare och kommer att kräva induktionsperioder över natten. Användning av alternativa värdstammar eller modifieringar av plasmidkonstruktionen kan vara nödvändig i vissa fall. Om fusionsproteinet förblir främst i inklusionskroppar även efter försök att erhålla lösligt protein kan det vara värt att skala upp produktionen av E. coli och rena tillräckligt med protein från den lilla mängden lösligt protein som är tillgängligt. I vissa fall bör andra fusionsproteintaggar undersökas.

9 låga proteinuttrycksnivåer kan vara resultatet av sällsynt kodonanvändning. I detta fall kan byte till en annan stam av E. coli som innehåller extra transkript för sällsynt kodon tRNA förbättra signifikant proteinproduktion. Olika medieformuleringar eller tillsats av upp 2% glukos kan också förbättra uttrycket (13, 14). Om det misstänks att det uttryckta proteinet är giftigt för cellerna (vanligtvis kommer de att sluta växa efter induktion med IPTG), försök inducera vid en senare tidpunkt under en kortare tid. Att minska IPTG-koncentrationen är ett annat alternativ som bör undersökas.

10övervaka celltillväxt genom att läsa den optiska densiteten vid 600 nm (A600). En nattkultur bör nå en A600 ~1-1.2. Celler bör induceras i en tidig fas av den logaritmiska tillväxtkurvan för E. coli, A600 ~ 0,5 till 0,7. Vid 37 kcal C tar det ungefär 2 timmar för kulturer att nå ett tidigt loggstadium av tillväxt. Om celler odlas vid en lägre temperatur måste inkubationstiden ökas, eftersom cellerna växer långsammare vid lägre temperaturer. Generellt kommer det största utbytet av fusionsprotein att erhållas när cellerna induceras vid A600 = ~ 0,5. Efter induktion med IPTG är en allmän riktlinje för inkubationstid följande: 3 h vid 37 CCG, 5 h vid 30 CCG och över natten för 25 CCG eller lägre. Skörda cellerna före mättnad, A600 ~ 1,0-1,2.

11 för att säkerställa tillräcklig luftning bör kolvar endast fyllas till 20-30% av sin kapacitet.

12det är viktigt att inga serinproteashämmare finns i provet före klyvning med trombin eller faktor Xa. Följande proteashämmare måste avlägsnas före trombin-eller faktor Xa-klyvning: AEBSF, APMSF, antitrombin III, antipain, 6-antitrypsin, aprotinin, chymostatin, hirudin, leupeptin och PMSF. Dessutom är Pefabloc TH benzamidin specifikt för trombin, och Pefabloc FXa är specifikt för faktor Xa. Följande proteashämmare bör undvikas med PreScission proteas: 100 mM ZnCl2, 100 occurm chymostatin och 4 mM Pefabloc.

13det finns ett antal alternativa metoder för detektion av GST-fusionsproteiner. För proteiner som uttrycker väl på en hög nivå, är den enklaste metoden för övervakning av reningen via SDS-PAGE geler färgade med Coomassie blå eller silver fläck. Ett alternativ för proteiner som uttrycker på låga nivåer är att använda Western blotting med hjälp av en antikropp riktad mot antingen GST eller målproteinet. Ett alternativ för småskaliga uttryck är att övervaka förekomsten av GST med en ELISA-eller CDNB-enzymanalys.

14spara en liten mängd proteinprov från varje steg i reningen, inklusive Lys, supernatant, pellets, obundna fraktioner från provbelastning, tvättsteg och elueringssteg som ska analyseras med SDS-PAGE eller Western blotting. När alla prover har analyserats och poolats, kassera oönskade fraktioner.

15gst-proteiner kan också renas med användning av en satsreningsmetod. En satsreningsmetod är snabb, enkel och kräver lite utrustning; det resulterande proteinet kan emellertid innehålla mer föroreningar och ha ett lägre utbyte än en kromatografibaserad rening. Batchreningar används bäst vid screening av reningsförhållanden. Batchreningen som beskrivs nedan utförs vanligtvis vid rumstemperatur. För att minimera risken för proteolytisk nedbrytning kan proceduren utföras vid 4 kcal C genom att öka inkubationstiden 2 till 4 gånger.

1. Lyseceller och få lösligt fusionsprotein (se Not 8 och 21 om provet finns i inklusionskroppar).

2. tillsätt 2 ml 50% uppslamning glutation Sepharose bulkmatris (1 ml bäddvolym) per 100 ml bakterielysat supernatant. Inkubera 30 min vid rumstemperatur med mild omröring.

3. Centrifugera 500 kcal g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och spara för analys av SDS-sida för att bestämma bindningseffektiviteten.

4. tvätta hartset med 10 bäddvolymer PBS. Försiktigt resuspend, och sedan Centrifugera 500 ci g för 5 min. Ta bort supernatanten. Upprepa tvätt-och centrifugeringssteg för totalt 3 tvättar med 10 bäddvolymer vardera.

5. eluera fusionsproteinet genom att resuspendera hartset med 1,0 ml glutation elueringsbuffert per ml bäddvolym. Inkubera 10 min vid rumstemperatur. Centrifugera 500 kcal g i 5 minuter. Överför den fusionsproteininnehållande supernatanten till ett separat rör. Upprepa eluering och uppsamlingssteg totalt 3 gånger. Supernatanterna kan samlas eller analyseras separat av SDS-sida för att övervaka proteininnehållet (Se anmärkning 12).

16A bäddvolym är lika med hälften av 50% uppslamning av glutation Sepharose 4B som används för rening. För att förbereda en 50% uppslamning av glutation Sepharose (den levereras som ~ 75% uppslamning): Bestäm bäddvolymen som krävs för reningsskalan. Resuspendera glutation Sepharose 4B. för varje ml bäddvolym som krävs, pipettera 1,33 ml av 75% uppslamningen till ett lämpligt centrifugrör. Centrifugera vid 500 kcal g i 5 minuter. Dekantera super. Tvätta med 10 bäddvolymer (10 ml per 1,33 ml originaluppslamning) av PBS genom att försiktigt vända röret flera gånger för att blanda, Centrifugera sedan 500 kcal g i 5 minuter. Dekantera super. Underlåtenhet att ta bort etanollagringslösningen kan störa efterföljande bindningssteg. Tillsätt 1 ml PBS för varje 1,33 ml av den ursprungliga uppslamningen. Detta resulterar i en 50% uppslamning.

17glutation Sepharose har en annonserad minsta bindningskapacitet på 8 mg/ml. En kolonn på 20 ml bör vara tillräcklig för att rena protein från 3 600 ml E. coli-kulturer som innehåller ~ 20-40 mg fusionsprotein per kultur. Både mängden harts som används och kolonnstorleken kan skalas upp eller ner beroende på mängden protein som ska renas.

18resuspendera pelleten med 25-50 occoll tvättbuffert per ml originalkultur.

19cellstörning är klar när suspensionen delvis rensas och blir en något mörkare färg. Undvik skumning under ultraljudsbehandling, eftersom detta kan leda till denaturering av fusionsproteinet. Undvik översonikering, eftersom detta kan leda till samrening av värd-E. coli-proteiner tillsammans med GST-fusionsproteinet. Hög viskositet på grund av frisättning av nukleinsyror under ultraljudsbehandling kan reduceras genom tillsats av DNas eller bensoas till Lys buffert. Lysozym upp till en koncentration av 0.2 mg / ml kan tillsättas som ett hjälpmedel för celllys. Ett alternativ till ultraljudsbehandling är användningen av kommersiellt tillgängliga cell-extraktion formuleringar. Dessa produkter kan dock innehålla egna komponenter som stör nedströms applikationer.

20om försök att flytta uttryck från inklusionskroppar till den lösliga fraktionen misslyckas, kan olösliga GST-fusionsproteiner ibland renas i närvaro av denaturanter såsom urea, följt av återfyllning. Solubilisering med tvättmedel som sarkosyl (N-laurylsarosin) har också framgångsrikt använts (15, 16). Även om följande protokoll har använts framgångsrikt för att denaturera och re-nature GST-fusionsproteiner, är varje fusionsproteinkonstruktion unik och de exakta denaturerings-och re-naturationsbetingelserna måste bestämmas empiriskt. Vanliga denaturanter som framgångsrikt har använts inkluderar guanidin HCl, urea, Tween 20, CTAB och SDS (17, 18). Denaturanterna måste sedan avlägsnas helt för att möjliggöra korrekt återfyllning av proteinet. Villkor som bör optimeras för att underlätta återfyllning inkluderar: typ av denaturant, pH, närvaro av reduktionsmedel, hastighet för avlägsnande av denaturant och proteinkoncentration. När proteinet har blivit remodigt, verifiera att proteinet har återfått sin ursprungliga konformation och funktion och ta bort eventuellt felaktigt vikta protein.

1. Pre-equilibrate glutation Sepharose kolonn; sonicate pelleterade E. coli celler, och separera lysat supernatant och pelletsfraktioner genom centrifugering (se 3.3 affinitets rening av GST fusion protein steg 1-8). Resuspendera lysatpelleten som innehåller inklusionskropparna, i 15 ml tvättbuffert. Centrifugera 20 min vid 48,000 xnumx xnumx g (4 xnumx xnumx C). Dekantera supernatanten och omsuspendera den tvättade pelleten i 12 ml U-buffert (omsuspendera i 20 oC-l U-buffert per ml originalkultur). Inkubera 2 timmar på is.

2. Centrifugera 20 min vid 48,000 xnumx xnumx g (4 xnumx xnumx C). Överför supernatanten som innehåller det denaturerade fusionsproteinet till ett rent centrifugrör.

3. tillsätt Triton X-100 till supernatanten till en slutlig koncentration på 1%.

4. Dialysera provet i PBS / glycerol i 2-3 timmar. volymen av dialysbufferten bör vara minst 20 gånger provvolymen.

5. Dialysera provet över natten kontra PBS med proteashämmare med hjälp av en buffertvolym som är >100 gånger provvolymen.

6. ta bort provet från dialys och centrifugera 20 min vid 4,000 xnumx kg.

7. extraherat och återmodigt protein från inklusionskropparna kan nu appliceras på glutation Sepharoskolonner och renas.

lösningar:

tvättbuffert: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mm PMSF, pH 8.0

U buffert: 5 M urea, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-MIG, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/glycerol: 1X PBS, 20% glycerol, 1% Triton X-100, 5 mM 2-ME, 5 mM EDTA, 5 mM 2 – MIG, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use av en peristaltiska pumpen är designad för att jämnt och kontrollera flödet priser. Om komprimering av hartset inträffar är trycket för högt och flödeshastigheten bör minskas.

22bindningskinetiken mellan glutation och GST är relativt långsam. Därför är det viktigt att använda låga flödeshastigheter för att uppnå maximal bindningskapacitet, t.ex. 0,1 ml/min för en 2,5 cm ID-kolonn. Användning av flödeshastigheter som är för snabba kan minska mängden bundet fusionsprotein på grund av den långsamma kinetiken i föreningen. Tvätt-och elueringssteg kan utföras med snabbare flödeshastigheter för att spara tid (1,5 ml/min respektive 0,3 ml/min). För stora volymprover utförs bindning lämpligast över natten, med justeringar av flödeshastigheter så att kolonnen inte går torr.

23analys av de obundna fraktionerna indikerar om fusionsproteinet är bindande eller inte. Om proteinet inte detekteras i tidiga fraktioner men visas i senare fraktioner, indikerar det att kolonnkapaciteten har överskridits. Minskning av proteinbelastning eller ökning av kolonnstorlek kommer att lindra detta tillstånd.

24om fusionsproteinet binder dåligt till glutationsefarosen finns det flera alternativ för att försöka öka bindningseffektiviteten. Prova en mildare lysmetod. Om den använda metoden är för hård kan proteinet bli denaturerat och därför inte kunna binda till kolonnen. Också, om re-naturing proteinet från inklusionskroppar, vara säker på att alla denaturanter har tagits bort från bufferten, antingen genom uttömmande dialys eller applicering av provet till en avsaltningskolonn, innan de appliceras på glutationkolonnen. Ta bort etanollagringslösningen från glutationsepharosen; minska kolonnen med färsk glutationbuffert följt av en tvätt med PBS omedelbart före provbelastningen. Öka mängden harts och / eller minska flödeshastigheten som används för att ladda provet. Försök lägga till 1-20 mM DTT i provet. Om ett problem fortfarande kvarstår, rengör kolonnen enligt tillverkarens rekommendation. Om bindningen fortfarande inte återställs, försök använda färskt harts.

25utbytet av fusionsprotein kan också uppskattas genom mätning av absorbans vid 280 nm (A280). Utrotningskoefficienten för GST-delen ensam är ~ 1,5, dvs 1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml protein, även om utrotningskoefficienten för fusionsproteinet delvis beror på absorbansegenskaperna hos målproteinet.

26om det finns ett problem att eluera proteinet från glutation Sepharoskolonnen, försök minska flödeshastigheten och öka volymen elueringsbuffert som används. Var noga med att använda färsk reducerad glutationbuffert (gör det dagen då det kommer att användas). Öka koncentrationen av glutation upp till 40 mM och/eller höja buffertens pH till pH 8,0–9,0. Tillsätt 1-20 mM DTT (eller annat reduktionsmedel) till bufferten. Tillsats av ett nonjoniskt tvättmedel kan också förbättra solubiliseringen och minimera eventuell aggregering som kan uppstå.

27förorening av det renade fusionsproteinet med E. coli-värdcellproteiner är en indikation på att ultraljudsbehandling har varit för svår. Om nedbrutna fragment av fusionsproteinet är närvarande, försök att tillsätta ytterligare proteashämmare till lysbufferten. Håll alla prover, buffertar och uppsamlingsrör kalla för att minimera proteolys. Om nedbrytning sker under proteinuttryck, försök inducera provet sent (~0.8 OD600) och minska längden på induktionsperioden. Att byta till en alternativ värdstam kan också hjälpa.

28ett alternativ till nedbrytning i lösning är proteas klyvning av fusionsprotein medan bundet till glutation Sepharosmatrisen. Fusionsproteinet extraheras och laddas på glutationsepharosen följt av tvättning med PBS (se affinitetsrening av GST-fusionsprotein, steg 1-11). I stället för att eluera proteinet med glutationbuffert, laddas en PBS-lösning innehållande enzymet på kolonnen och inkuberas i flera timmar vid rumstemperatur (4 msk C för Prescissionsproteas). Det klyvda proteinet tvättas sedan ut ur kolonnen med flera kolonnvolymer av PBS. Restfusionsprotein och GST-delen kan avlägsnas från kolonnen genom att tvätta kolonnen med reducerad glutationbuffert. Mängden enzym och inkubationstid måste empiriskt bestämmas för varje fusionsprotein. Analysera alla prover med SDS-sida för att bestämma klyvningseffektivitet och proteinrenhet.

29tillsätt en empiriskt bestämd mängd enzym i det fusionsprotein som är bundet till hartset (Se anmärkning 15 a–d). Använd 1 ml PBS-innehållande enzym per ml bäddvolym. Inkubera vid rumstemperatur i flera timmar med mild omröring. Centrifugera 500 kg i 5 minuter för att sedimentera hartset. Ta bort super som innehåller målproteinet till ett separat rör. Tvätta glutationsepharosen med PBS upp till 3 gånger för att återvinna det klyvda fusionsproteinet. Inkubera hartset med glutationbuffert för att avlägsna GST och kvarvarande fusionsprotein. Använd 1 ml glutationbuffert per ml harts. Centrifugera 500 kcal g och återvinna eluerad GST. Upprepa upp till 3 gånger. Analysera prover av SDS-sida.

30om man använder trombinproteas kan matsmältningen utföras i glutationbufferten som används för att eluera proteinet från kolonnen. Om faktor Xa används rekommenderas det att dialysera proteinet i antingen en Tris-buffert eller PBS-buffert före matsmältningen; glutation närvarande i elueringsbufferten kan störa disulfidbroarna närvarande i faktor Xa vilket leder till ineffektiv matsmältning av fusionsprotein. En empirisk bestämning av matsmältningsförhållandena för varje fusionsprotein måste bestämmas i ett pilotförtunningsexperiment. En lämplig metod är att smälta 100 USC fusionsprotein över ett intervall av enzym-till-substratförhållanden och variera inkubationstiden. Typiska inkubationstider sträcker sig från 2 till 8 timmar. rekommenderade enzym-till-substratförhållanden för trombin är 1:100, 1:350, 1:1000, och 1:3000 (enheter av enzym per kg fusionsprotein) och för faktor Xa är 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (enzymet per enzymet per fusionsprotein (t.ex. Vid önskade tidpunkter, ta bort 2 occurg protein och stoppa matsmältningen genom att tillsätta prov alikvoten till kokande SDS-provbuffert. Analysera proverna med SDS-sida för att bestämma de optimala klyvningsförhållandena. Förutom enzym-till-substratförhållande och tid, överväg att ändra buffertförhållanden, såsom att öka eller minska NaCl-koncentrationen eller lägga till Ca2+ i bufferten (Se not 31 för felsökningstips).

31om flera band observeras på SDS-sidan för målproteinet efter matsmältningen, kontrollera målproteinsekvensen för potentiella sekundära proteasigenkänningsställen. Om sekundära klyvningsställen finns, klona om till en annan vektor. Om ingen klyvning observeras, kontrollera DNA-sekvensen för att verifiera närvaron och integriteten hos det förväntade proteas klyvningsstället. Se till att proteashämmare har tagits bort helt från bufferten. Lägg till mer enzym och / eller öka inkubationstiderna till över natten. Om matsmältningen förblir ofullständig vid de högsta enzym-till-substratförhållandena och längsta tidpunkterna, överväga att reengineera proteas klyvningsstället för att inkludera flera glyciner mellan GST-delen och målproteinet för att minska sannolikheten för steriskt hinder som stör klyvningen (19, 20).

32om hämning av enzymet efter att matsmältningen är klar med serinproteashämmare är oönskad, kan provet appliceras på en HiTrap-bensamidinkolonn för att avlägsna enzymet från provet.

33om provet ska återkromatograferas på glutationsepharoskolonnen för att avlägsna GST och eventuellt osmält fusionsprotein är det viktigt att den reducerade glutation avlägsnas fullständigt från provet. Glutation balanserar mycket långsamt över dialysmembran; därför om dialysslang med en MWCO <12 000 används, kan 3 eller fler buffertförändringar krävas för fullständigt avlägsnande. Ökad dialystid (över natten) och en större volym buffert kan också krävas för stora provvolymer.

34samma glutation Sepharoskolonn kan användas för både initial isolering av fusionsproteinet och för repurifiering efter enzymatisk klyvning. Det rekommenderas att ägna en enda kolumn till en enskild proteinkonstruktion för att undvika potentiell korskontaminering av olika rekombinanta proteiner. Kolumner kan återanvändas flera gånger. Om bindningseffektiviteten minskar med tiden, rengör kolonnen enligt tillverkarens rekommendationer. Om bindningsaktiviteten inte återställs ska en ny kolumn användas.

35Maximal bindning uppstår om kolonnen är helt reducerad; om glutationsepharoskolonnen har tvättats mindre än 48 timmar före detta steg kan detta steg hoppas över.

36målproteinet kommer att vara i den obundna fraktionen och GST och alla icke-klyvda fusionsprotein kommer att binda till kolonnen.

37små provvolymer rekommenderas för god upplösning av målprotein jämfört med andra föroreningar. Om det inte är möjligt att koncentrera provet till en liten volym kan flera injektioner av provet utföras.