PMC

CPV-2 är det huvudsakliga etiologiska medlet för viral gastroenterit hos hundar. Det är en medlem av familjen Parvoviridae, som tillhörprotoparvovirus-släktet och Protoparvovirus typ 1-arter. Det är ett icke-inneslutet virus med ett enkelsträngat DNA-genom, vilket kodar för två kapsidproteiner, VP1 och VP2, som krävs för montering och förpackning av virusgenomet, liksom för ns1-och NS2-icke-strukturella proteiner, vilket hjälper till att kontrollera DNA-replikation, montering och reglering av generuttryck .

under de senaste åren har CPV-2 utvecklat nya antigena varianter. 1980 ersattes CPV-2 originalstam med varianten betecknad typ 2a (CPV-2a), 1984 identifierades CPV-2b,och 2001 upptäcktes och rapporterades CPV-2C i Italien. Den sista varianten har också identifieratsi Asien, Afrika och Amerika. På grund av förekomsten av flera antigena varianter för CPV-2 kan de kliniska tecknen variera kraftigt .Därefter har veterinärer mindre säkerhet när de utfärdar sin presuntiva diagnos, och vanligtvis krävs vissa laboratorietester för attbekräfta deras diagnos; även om flera tekniker har utvecklats i forskningslaboratorier, såsom hemagglutinationsanalyser, immunofluorescens, ELISA, PCR, immunokromatografitest och cellodling (bland andra), faktiskt tekniker med störst tillgänglighet inom kliniska laboratorier på veterinärmedicinska sjukhusendast är immunokromatografitestet och PCR, men i forskningen om känsligheten och specificiteten hos dessa förfaranden är rapporterna kontroversiella.Vidare har känsligheten och specificiteten hos dessa tekniker inte studerats i stor utsträckning hos patienter med varierande grad av sjukdomens svårighetsgrad.

syftet med denna studie är att rapportera de fördelar och nackdelar som erbjuds av immunokromatografitest och PCR för diagnos av patienter som uppvisar enbred mångfald av kliniska tecken för CPV-2.

denna studie genomfördes enligt riktlinjerna för Experimental Animal Research Mexican Official Norm NOM-062-ZOO-1999.

hundar med klinisk enterit på sjukhus på veterinärsjukhuset för små djur vid Universidad autu-tu-Cu-Cu-Cu-Cu, undersöktes för dettastudie och valdes baserat på testad positiv eller negativ CPV-2 med användning av kapslad PCR (nPCR). Som ett resultat valdes 45 hundar som testades positivt och 5 negativtestade hundar inkluderades som kontroller. De 50 hundarna undersöktes kliniskt av tre veterinärer samtidigt för att få känslighet för klinisk diagnos. Varjeveterinär utfärdade sin presumtiva diagnos på ett diskret sätt med hjälp av problem oriented veterinary medical record (POVMR) som deras diagnostiska verktyg.

därefter analyserades fekala prover av alla hundar genom PCR och immunokromatografitest, medan blodprover användes för att utföra ett fullständigt blodantal.

nPCR anses vara en mycket pålitlig och känslig teknik för att identifiera CPV-2-viruspartiklar , och därför korrelerades känsligheten hos de använda testen i denna studie med de som tidigare erhållits från nPCR för CPV-2diagnos.

hundens avföringsprover erhölls med användning av rektala svabbar, som suspenderades i nukleasfritt vatten och 200 oc h av homogenaten och användes forDNA-extraktion. Förfarandet utfördes med användning av QIAamp-DNA-avföringssatsen för DNA-extraktion (QIAGEN, Mainz, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Alldna-prover kvantifierades med användning av en Q5000 Quawell-spektrofotometer (Quawell Technology, Inc., San Jose, Kalifornien, USA). 100 ng DNA av varje provanvändes för PCR-reaktioner med 50 occyl slutlig volym. Tidigare designades ett par primers i vårt laboratorium för att förstärka ett 275 bp-fragment, ParvoInt2FB (5′-tcaagcagatggtgatccaag-3′) och ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTAATGCAGTTA–3′) som ligger vid nukleotider 1,107–1,130 och 1,360-1,382 av VP2-genen (Genbankaccessionsnummer fj0051962c).

PCR-reaktioner utfördes med användning av 2 Baccarat av varje primer (200 nM), 12,5 Baccarat av GoTaq Baccarat Green Master Mix (Promega, Madison, WI,U. S. A.) innehållande DNA-polymeras, reaktionsbuffert (pH 8,5) och 400 Baccarat av varje nukleotid (dATP, dGTP, Dctp och dTTP); 3 mM MgCl2.och 28.5 occyl av nukleasfritt vatten. Alla reaktioner utfördes under följande amplifieringsbetingelser; 1 cykel vid 94 kg C under 5 min förinitial denaturering, följt av 35 cykler vid 94 kg C under 30 sek, 52 kg C under 1 min, 72 kg C under 1 min och en slutlig förlängningscykel vid 72 kg C under 5 min.

nPCR gjordes initialt förstärka ett fragment av 1,740 bp med ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) och ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTTCATATAC-3′) primers,och designades med användning av nukleotidsekvenserna 1-20 och 1,712–1,740 från Gen VP2 för hundparvovirus (GenBank anslutningsnummer fj0051962c). Reaktionen varstandardiserad till en slutlig volym av 50 occyl.

reaktionen blanda innehöll 1 µl av GoTaq® Flexi DNA-Polymeras 5 U/µl (Promega), 5 µl av GoTaq® Flexi buffert 5XGreen, 3 µl av MgCl2 25 mM, 4 µl dNTP är 200 µM, 2 µl av primers, 10 µl DNA med en slutlig koncentration av 100 ng och 23 µl av nuclease gratis vatten. Reaktionen utfördesunder följande förstärkningsbetingelser: 1 cykel vid 94 C / 5 min, följt av 35 cykler vid 94 C / C i 30 SEK, 50 C / C i 45 sek, 72 C / C i 1 min och 1 cykel vid72 c / c i 5 min. Därefter användes 1 sekl av produkten av denna reaktion som en DNA-mall för nestningsförfarandet, och primers ochförstärkningsbetingelser var desamma för 275 bp-fragment.

alla amplifieringsprodukter identifierades genom horisontell elektrofores i 2% agarosgeler färgade med 0,5 ochetidiumbromid och visualiserades med en UV-transilluminator.

för analys av immunokromatografitest för canine parvovirus (CPV Ag), ANIGEN Kazaki kit (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) användes. Varje test utfördes enligt tillverkarens instruktioner.

blodprover togs från halsvenen med vacutainer-rör med EDTA som antikoagulant. Komplett blodcellsantal (CBC) utfördes med hjälp av anautomated cell counter (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, mig, USA). Blodfilmerna färgades med Wright-Giemsa och undersöktes under ett fotoniskmikroskop. Leukopeni övervägdes när ett totalt CBC-antal var mindre än 6 203/103 / cu .

resultatanalys utfördes genom användning av en matris för kodade variabler och beredskapstabeller skapadesatt bestämma de diagnostiska testegenskaperna . Dessutom bestämdes Kappastatistiken för att bedöma avtalet mellan de tre använda testerna och nPCR. Kappa-värdet karakteriserades enligt Kantere och kollegor 2015 där kappa-värdet 1 indikerar absolut överenskommelse, medan ett värde på 0 indikerar att överenskommelse uppstår på grund av slump. I allmänhet indikerar Kappa-värden högre än 0, 6 en bra avtalsnivå; analysen utfördes med hjälp av det statistiska paketet SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, USA).

nittio en punkt en (91,1) % av positiva hundar för CPV-2 av nPCR var rena uppfödda; 95.5% av patienterna var mellan två och åtta månader gamla och 4,5% var äldreän ett år. När det gäller deras vaccinationsstatus vaccinerades 40% minst en gång för att förhindra CPV-2-infektion.

frekvensen av kliniska tecken som dessa hundar visade var följande: 44, 4% uppvisade kräkningar och diarre; 20% hade feber, kräkningar och diarre(katarrhal eller hemorragisk); 17, 7% uppvisade endast diarre; 8, 8% uppvisade endast kräkningar; och 4, 4% hade diarre och feber och 4, 4% uppvisade kräkningar och feber.Leukopeni observerades hos 48,8% av hundarna (Tabell 1).

med klinisk undersökning diagnostiserade veterinärer endast 57,8% av patienterna positiva till CPV-2 och 100% av de negativa hundarna; därför uppskattades känslighetsvärdet förklinisk diagnos till 57,7% (CI0.95 42,2–72) och den observerade specificiteten var 100% (CI0.95 46,2–98,8).

när det gäller laboratorietester diagnos, av 100% av hundar som resulterade positivt genom nPCR, var endast 30/45 av dessa patienter CPV-2-positiva genomimmunokromatografitest, medan de fem kontrollpatienterna som testade negativa för CPV-2 diagnostiserades korrekt. Därför visade denna teknik en känslighetav 66,6% (CI0.95 50,9–79,5) och den observerade specificiteten var 100% (CI0.95 46,2–98,8).

med PCR-teknik var 36/45 patienter positiva till CPV-2 och de fem kontrollpatienterna bekräftades negativa i hela nPCR. Således visade PCR asensitivitet på 80% (CI0.95 63,1–87,7) och en specificitet på 100% (CI0.95 67,8–99,1) (Fig. 1).

överenskommelse mellan de tre teknikerna demonstreras genom Kappa-värdet (Tabell 2).

gastroenterit orsakad av CPV-2 anses vara en av de viktigaste virussjukdomarna som påverkar hundar. Även om kliniska tecken på hundparvovirusinfektion kan variera, var de vanligaste tecknen rapporterade: anorexi, depression, slöhet, feber ,mucoid och hemorragisk diarre och leukopeni ; i subkliniska fall kan vissa av dessa tecken vara eller inte vara närvarande .

under klinisk undersökning observerades variabilitet i kliniska manifestationer av infektion. Endast 20% av de studerade hundarna presenterade typiska tecken som vanligtbeskrivs i litteraturen. Klinisk variabilitet för denna sjukdom har rapporterats tidigare, och vissa författare har diskuterat faktorer, såsom ålder, immunstatus, Exponeringsväg, viral dos, virulens av stammar och saminfektion medandra smittämnen som möjliga orsaker . Detta komplicerar att få en noggrann diagnos av CPV-2 när veterinärer endast är beroende av sin kliniska undersökning. Därför, när det gäller vårundersökning enbart baserat på denna procedur, kommer 42,2% av hundarna att ha en falsk negativ CPV-2-diagnos.Genom hundar medicinska journaler i denna studie observerade vi attveterinärer utesluter möjligheten till infektion främst på grund av att hundarna inte uppvisade de klassiska kliniska tecknen som beskrivs i litteraturen, hade vaccinerats mot CPV-2 och/eller var vuxna. Men de flesta hundarna i vår studie visade atypiska tecken. Därför tror vi att subkliniska infektionerav CPV-2 är vanligare, och veterinärer, som måste bestämma huruvida man ska använda ytterligare diagnostiska tester med hög känslighet och specificitet, bordeallvarligt överväga dessa resultat.

i denna studie hade 40% av patienterna positiva till CVP-2 tidigare immuniserats. Det är välkänt att PCR-tekniken är mycket känslig och därför detekterarvaccinviruspartiklar i avföring från nyligen vaccinerade patienter; studier tyder på att det är möjligt att erhålla falskt positiva resultat från dag 3 till 10postvaccination med ett modifierat levande CPV-vaccin . Följaktligen att utföradenna studie utesluts patienter med vaccinationshistoria de senaste 15 dagarna. Dessutom sekvenserades prover från vaccinerade hundar positiva till CPV-2, och i alla studerade fall identifierades genovarianten CPV-2C (data visar inte), vilket innebär att hundar infekterades med fält CPV-2C, med vetskap om att ingen CPV-2cvaccin finns ännu i Mexiko. Dessutom rapporterade Pedroza och kollegor i Mexiko att den vanligaste antigena varianten hos infekterade hundar var CPV-2C .

å andra sidan anser många veterinärer närvaron av leukopeni, en stödjande faktor för CPV-2-diagnos. Vi observerade dock att endast 48.8% (22/45) av de studerade hundarna presenterade leukopeni under utvärderingen, vilket överensstämmer med andra rapporter som indikerade att cirka 50% av hundarna inte uppvisar hematologiska terationer vid utvärderingen . Därför är en CBC ett värdefullt verktyg som kan ge information omsjukdomens svårighetsgrad, vilket tyder på en prognos och bestämmer svaret på behandlingen. Leukopeni bör dock inte betraktas som ett diagnostiskt verktyg för CPV-2,eftersom det inte ger bevis för virusnärvaro.

olika tekniker för virusidentifiering används för definitiv bekräftelse av infektion med CPV-2, till exempel snabba tester baserade på immunokromatografianvänds ofta av kliniker, eftersom förfarandet är enkelt, snabbt och tillgängligt. Dessutom kräver det inte provberedning eller sändning till en specialiseradlaboratorium för analys. Den varierande känsligheten för detta test är dess nackdel; flera studier har visat att dess känslighet varierar från 50 till 100% , och i vår studie var den jämförande känsligheten med nPCR 66, 6%. Vissa studier harföreslog att den låga teknikkänsligheten beror på behovet av en stor viruspartikelmängder som ska kasta in i hundens pall för att få en positivdiagnos . Användningen av denna teknik måste omprövas, eftersom högre sannolikhet för falska negativa resultat förväntas. För att förhindra detta måste ytterligare tekniker med högre känslighet användas .

flera studier har visat den höga känsligheten hos PCR-baserade tester; för närvarande finns det flera varianter av samma procedur som erbjuder känslighetersträcker sig från 80 till 100% . I den föreliggande studien hade PCR 80% känslighet, och det är anmärkningsvärt att nämna att patienter endast identifierades positiva tillinfektion genom nPCR under tiden kunde varken PCR eller immunokromatografitester identifiera det.

beträffande kappa-värdet jämförde vi resultat bland de tre analyserade metoderna med nPCR. Den dåliga överenskommelsen mellan klinisk diagnos och npcr demonstrerades ändå; måttlig överenskommelse observerades mellan konventionell PCR och nPCR vilket kan bero på likheten mellan de två testerna.

vad gäller kliniska tecken observerades förekomst av antingen kräkningar eller diarre hos alla virusinfekterade patienter, medan andra kliniska tecken inte ansågs relevanta för infektionen; i överensstämmelse med kliniska tecken och känslighet hos de använda teknikerna observerades inget samband. Till exempel fall nr 26 visade endast kräkningar som ett kliniskt tecken, och det ansågs negativt för CPV-2 genom veterinär klinisk diagnos, men immunokromatografitest, PCR och nPCRtests var positiva för CPV-2. Vidare kunde fall 41 och 42 där det huvudsakliga kliniska tecknet var diarre endast diagnostiseras positivt för CPV-2 med nPCR.

våra data indikerar att de mest använda diagnostiska testerna i kliniska och diagnostiska veterinärlaboratorier för att upptäcka CPV-2 är mycket specifika, men debrist på känslighet, vilket förhindrar den exakta diagnosen CPV-2. I vår studie var PCR – och immunokromatografitest inte lika känsliga som nPCR, vilket bekräftadesi tidigare undersökningar är användningen av nPCR som diagnostest ännu inte utbredd på veterinärsjukhus , medan den fortfarande används i stor utsträckning för forskningsändamål.

å andra sidan används PCR i realtid, som också är mycket känslig, sällan på grund av dess höga utrustningskostnader och kravet på en mycket specialiserad personal för dess hantering. Tekniska framsteg gjorde det dock möjligt för dessa tekniker att bli billigare och enklare att använda, vilket kan leda till deras direkta tillämpning på veterinärsjukhus för att förbättra diagnostisk noggrannhet för CPV-2.