Proteinreningedit
Polyhistidin-taggar används ofta för affinitetsrening av polyhistidin-märkta rekombinanta proteiner uttryckta i Escherichia coli och andra prokaryota uttryckssystem. Bakterieceller skördas via centrifugering och den resulterande cellpelleten lyseras antingen med fysiska medel eller med hjälp av tvättmedel och enzymer såsom lysozym eller någon kombination av dessa. I detta skede innehåller rålysat det rekombinanta proteinet bland många andra proteiner som härrör från bakterievärden. Denna blandning inkuberas med ett affinitetsharts innehållande bundna tvåvärda nickel-eller koboltjoner, som är kommersiellt tillgängliga i olika sorter. Nickel och kobolt har liknande egenskaper och eftersom de är angränsande period 4 övergångsmetaller (V. järntriad). Dessa hartser är i allmänhet sefaros/agaros funktionaliserad med en kelator, såsom iminodiättiksyra (Ni-Ida) och nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) för nickel och karboxylmetylaspartat (Co-CMA) för kobolt, som polyhistidin-taggen binder med mikromolär affinitet. Ernst Hochuli et al. kopplade 1987 NTA ligand och Nickel-joner till agarospärlor. Hartset tvättas sedan med fosfatbuffert för att avlägsna proteiner som inte specifikt interagerar med kobolt-eller nickeljonen. Med Ni-baserade metoder kan tvätteffektiviteten förbättras genom tillsats av 20 mM imidazol (proteiner elueras vanligtvis med 150-300 mM imidazol). I allmänhet har nickelbaserade hartser en högre bindningskapacitet, medan koboltbaserade hartser erbjuder högsta renhet. Renheten och mängden protein kan bedömas med SDS-PAGE och Western blotting.
affinitetsrening med hjälp av en polyhistidin-tagg resulterar vanligtvis i relativt rent protein när det rekombinanta proteinet uttrycks i prokaryota organismer. Beroende på nedströmsapplikationer, inklusive rening av proteinkomplex för att studera proteininteraktioner, kan rening från högre organismer såsom jäst eller andra eukaryoter kräva en tandemaffinitetsrening med två Taggar för att ge högre renhet. Alternativt ger enstegsrening med immobiliserade koboltjoner snarare än nickeljoner i allmänhet en väsentlig ökning av renheten och kräver lägre imidazolkoncentrationer för eluering av det his-märkta proteinet.
Polyhistidin-märkning är alternativet för att rena rekombinanta proteiner under denatureringsförhållanden eftersom dess verkningssätt endast är beroende av proteins primära struktur. Till exempel, även när ett rekombinant protein med våld uttrycks i E. coli producerar en inklusionskropp och kan inte erhållas som ett lösligt protein, det kan renas med denaturering med urea eller guanidinhydroklorid. I allmänhet titreras histidinbindning för denna typ av teknik med pH istället för imidazolbindning—vid ett högt pH binder histidin till nickel eller kobolt, men vid lågt pH (~6 för kobolt och ~4 för nickel) blir histidin protonerat och konkurreras av metalljonen. Jämför detta med antikroppsrening och GST-rening, en förutsättning för vilken är korrekt (nativ) vikning av involverade proteiner. Å andra sidan sägs det att His-taggen tenderar att aggregera och insolubilisera mer än andra affinitetstaggar.
polyhistidin-tag-kolumner behåller flera välkända proteiner som föroreningar. En av dem är peptidylprolylisomeras av fkbp-typ, som förekommer runt 25kda (SlyD). Föroreningar elimineras vanligtvis med hjälp av en sekundär kromatografisk teknik eller genom att uttrycka det rekombinanta proteinet i en SlyD-bristfällig E. coli-stam. Alternativt har jämförelse med nickelbaserade, koboltbaserade hartser mindre affinitet med SlyD från E. coli, men i flera fall är det måttligt användbart.
proteiner med olika antal polyhistidintaggar eluerar annorlunda än nickelaffinitetsharts. För proteiner med en enda hexahistidin-tagg möjliggör 75 mM imidazol eluering från Ni-NTA, medan för proteiner med två hexahistidin-taggar krävs 100 mM imidazol för eluering. Denna stegvisa eluering kan användas för att isolera specifika proteinaggregat från en blandning, såsom definierade heteromultimerer (t.ex. en AB-heterodimer från en blandning inklusive AA-och BB-homodimerer, om endast subenhet B har en polyhistidin-tagg). Ett sådant tillvägagångssätt användes i isolering av monovalent streptavidin.
Bindningsanalysedit
Polyhistidin-märkning kan användas för att detektera protein-protein-interaktioner på samma sätt som en pull-down-analys. Emellertid anses denna teknik allmänt vara mindre känslig och begränsas också av några av de mer finiga aspekterna av denna teknik. Till exempel kan reducerande förhållanden inte användas, EDTA och många typer av tvättmedel kan inte användas. De senaste framstegen inom dubbelpolariseringsinterferometri är mottaglig för EDTA och en bredare användning av reagens, och användningen av sådana platsspecifika taggar förenklar i hög grad den direkta mätningen av tillhörande konformationsförändring.
fluorescerande taggedit
Hexahistadine CyDye-taggar har också utvecklats. Dessa använder Nickel kovalent samordning till EDTA-grupper kopplade till fluoroforer för att skapa färgämnen som fäster vid polyhistidin-taggen. Denna teknik har visat sig vara effektiv för att följa proteinmigration och handel. Det har också funnits nya upptäckter som visar att denna teknik kan vara effektiv för att mäta avstånd via fluorescerande Resonansenergiöverföring.
en polyfluorohistidin-tagg har rapporterats för användning i in vitro-översättningssystem. I detta system används en expanderad genetisk kod där histidin ersätts med 4-fluorohistidin. Den fluorerade analogen införlivas i peptider via den avslappnade substratspecificiteten hos histidin-tRNA-ligas och sänker den totala PKA för taggen. Detta möjliggör selektiv anrikning av polyfluorohistidin taggade peptider i närvaro av komplexa blandningar av traditionella polyhistidintaggar genom att ändra pH hos tvättbuffertarna.
