TUNEL-analysen används oftast för att detektera celler som genomgår apoptos, vilket är en form av programmerad celldöd. Apoptos är en viktig biologisk process under utveckling och för att upprätthålla vävnadshomeostas. TUNELFÄRGNING möjliggör visualisering och kvantifiering av apoptotiska celler. Detta hjälper forskare att testa effekten av nya behandlingar för störningar där apoptos antingen hämmas, som i cancer eller förbättras, som i neurodegeneration.
denna video kommer att förklara hur TUNEL-analysen kan användas för att märka celler som genomgår apoptos, ett steg-för-steg-protokoll för att utföra denna metod i vävnadssektioner och hur forskare tillämpar denna teknik för att förstå mekanismer för celldöd.
innan vi går in i protokollet för TUNEL-analysen, låt oss diskutera principerna bakom denna teknik.
en av de många kännetecknen för apoptos är DNA-fragmentering. Hur uppstår DNA-fragmentering? Apoptos utförs av enzymer som kallas kaspaser närvarande i cytosolen. Deras primära roll är att klyva proteiner för att demontera cellen. Dessutom aktiverar kaspaser ett enzym som kallas caspasaktiverat DNas, eller CAD, genom att lossa det från dess hämmare—ICAD. Aktiverad CAD är ett endonukleas som reser till kärnan och klyver kromosomalt DNA.
klyvning av DNA orsakar slutligen ackumulering av DNA-fragment med nickade ändar, och TUNEL-analysen märker fluorescerande dessa nickade ändar av fragmenterat DNA, vilket gör det möjligt för forskare att upptäcka apoptos. Men hur händer detta? För det måste du förstå TUNEL-reaktionen. TUNEL står för terminal deoxynukleotidyltransferas-medierad dutp nick-end märkning. De två huvudsakliga TUNEL-reagenserna är terminal deoxynukleotidyltransferas, eller TdT, och deoxyuridintrifosfat, eller dUTP, som kan märkas fluorescerande för enkel detektering.
för att förstå TUNEL-reaktionen, låt oss gå tillbaka till de apoptotiska cellerna med DNA-fragment. Dessa nickade fragment har fria 3 ’ hydroxylgrupper. När du lägger till TUNEL-reagenserna i ett prov som innehåller apoptotiska celler, fäster de fluorescerande märkta dutp: erna till dessa 3’ – hydroxylgrupper med hjälp av katalysatorenzymet TdT. Cellerna som färgas med denna procedur kallas TUNEL-positiva celler, som sedan kan visualiseras med hjälp av fluorescensmikroskopi.
nu när du förstår de grundläggande principerna och begreppen bakom TUNEL-analysen, låt oss skissera ett allmänt protokoll för att utföra denna teknik i vävnadssektioner. De viktigaste stegen i TUNEL-analysen innefattar fixering av vävnaden av intresse, permeabilisering av vävnaden, tillsats av TUNEL-reagens, stopp av TUNEL-reaktionen och slutligen analysen.
först måste vävnaden av intresse fixas för att bevara biologiska strukturer. Fixering fungerar genom tvärbindning av proteiner i celler. För TUNEL-analysen kan vävnader fixas genom att tillsätta dem till en lösning innehållande 4% paraformaldehyd i 4-24 timmar vid 4 msk C. Efter fixering kryosektion vävnaden i tunna skivor av 10 m eller mindre.
nästa steg är permeabilisering, vilket gör det möjligt för reagenser som TDT-enzymet att tränga in i cellkärnan. Permeabilisering av vävnadssektioner kan utföras genom tillsats av vävnaden till proteinas k-lösning i 5-15 minuter vid 37 msk C. Skölj vävnadssektioner med fosfatbuffrad saltlösning på en orbital shaker i 15-30 minuter vid rumstemperatur.
efter permeabilisering tillsätts TDT-enzymet och fluorescerande märkta dUTPs till vävnadssektionerna, tillsammans med en märkningsbuffert innehållande kobolt som fungerar som en kofaktor för TUNEL-reaktionen. Tillsammans inkuberas TUNELREAKTIONSBLANDNINGEN och vävnadssektionen i 1-3 timmar vid 37 kcal C och skyddas från ljus för att förhindra att fluorescensen bleknar.
efter inkubation tillsätts stoppbuffert till vävnadssektionen för att upphöra med TUNELREAKTIONEN, och efter en kort inkubation tvättas sektionerna med fosfatbuffrad saltlösning. Slutligen visualiseras vävnadssektioner med fluorescerande märkta dUTP med hjälp av fluorescensmikroskopi och utvärderas för lokalisering av TUNEL-positiva celler i en given vävnad. Man kan kvantifiera celldöd helt enkelt genom att räkna andelen TUNEL positiva celler i en given vävnadssektion.
nu när du har sett hur man utför TUNEL-analysen för att upptäcka apoptotiska celler, låt oss diskutera hur denna analys kan användas för att ta itu med frågor som ställs av cellbiologer.
celldöd förekommer som en normal del av utvecklingen för skulptering av vävnader och strukturer och för eliminering av onödiga celler. Därför studerar forskare som är intresserade av detta fenomen effekten av prenatal exponering för olika ämnen på apoptos under utveckling. Här var forskare intresserade av att undersöka effekten av prenatal alkoholexponering på hjärnans utveckling. Resultaten av tunelfärgning utförd på fostrets hjärnor avslöjade ökad apoptos i vävnader som exponerades prenatalt för alkohol, jämfört med kontrolldjur.
forskare använder också TUNEL-analysen för att undersöka apoptos som svar på bakteriell infektion. I detta experiment utvecklade forskare en modell av lunginflammation genom att injicera möss med Pseudomonas aeruginosa, vilket inducerar lunginflammation. Därefter avlägsnades lungvävnad och TUNELFÄRGNING utfördes för att undersöka apoptos som svar på bakterieinfektionen. Resultaten visar att apoptotisk celldöd ökade hos möss utsatta för bakterierna, jämfört med kontrolldjur.
slutligen kan TUNELFÄRGNING användas på humana tumörprover för att bestämma tumörrespons på läkemedel. I detta exempel skördades tumörprover från humana patienter och odlades ex vivo. Därefter behandlades de med prekliniska Läkemedel och bedömdes för ett svar med TUNEL-analysen. Data som erhållits visar att behandling med ett läkemedel som hämmar värmechockprotein 90 signifikant ökar apoptos i tumörvävnad.
du har just tittat på joves video om att använda TUNEL-analysen för att upptäcka celler som genomgår apoptos. Denna video granskade principerna bakom tunelfärgning och ett steg-för-steg-protokoll för att utföra TUNEL-analysen på vävnadssektioner. Vi granskade också hur denna metod kunde tillämpas för att förstå programmerad celldöd under utveckling och sjukdom. Som alltid, tack för att du tittade!
