a comparação entre a descalcificação convencional e um método assistido por micro-ondas no tecido ósseo afectado pelo Micetoma

Abstract

Mycetoma é uma doença granulomatosa ao longo da vida dos tecidos e ossos subcutâneos. A histopatologia é um método indicativo fundamentado baseado no pressuposto de um diagnóstico definitivo de micetoma. Exige um processamento eficiente dos tecidos, incluindo a descalcificação óssea. O processo de descalcificação deve assegurar a remoção completa do cálcio e também a preservação adequada da capacidade de coloração dos tecidos e dos microrganismos. Objectivo. Comparar o método convencional utilizado na descalcificação com o método de microondas utilizando diferentes soluções de descalcificação. Foram testadas diferentes características, incluindo a velocidade de descalcificação e preservação morfológica e fúngica no tecido ósseo afectado pelo micetoma. Materiais e métodos. Foram utilizadas três soluções de descalcificação para remover cálcio de 50 amostras de tecido ósseo afectadas por micetoma, incluindo EDTA tamponada a 10% (pH 7.4), ácido nítrico a 5% e ácido clorídrico a 5%. Foram utilizados métodos convencionais e de microondas. Hematoxilina-eosina (HE) mancha, mancha de Gridley, e mancha de Hexamina-prata Grocott foram empregados para avaliar as morfologias ósseas e fungos. Resultado. O tempo de descalcificação do método convencional em comparação com o método de microondas com 10% de EDTA (pH 7.4) levou 120 horas e 29 horas, enquanto 5% de ácido clorídrico e 5% de ácido nítrico levou 8 horas e 3 horas, separadamente. Além disso, 10% de EDTA é o melhor agente de descalcificação para coloração e manchas de fungos. 5% de ácido clorídrico e 5% de ácido nítrico podem ser usados para coloração fúngica. Conclusao. O presente estudo investigou os efeitos de diferentes descalcificação agentes, bem como dois descalcificação procedimentos sobre a preservação da estrutura óssea e fungos de coloração, que vai ajudar a desenvolver protocolos adequados para a análise do tecido ósseo afetados com mycetoma infecção.

1. Introdução

Micetoma é uma doença epidémica granulomatosa ao longo da vida, gradualmente deletéria da pele e tecidos subcutâneos que podem progredir para estruturas mais profundas como músculos e ossos e levar à destruição extensiva, principalmente dos pés, exigindo grandes excisões cirúrgicas locais ou amputação dos membros . Micetoma é definido pelo Triumvirato de expansão, pelos seios extenuantes e pela existência de grãos coloniais nos exsudados inflamatórios . A infecção é classificada como eumicetoma (infecção fúngica) ou actinomicetoma (infecção bacteriana) . É uma condição das regiões tropicais e semitropicais, notavelmente do Sudão . Os grãos de Madurella mycetomatis são enormes, variando de 0,5 a 3 mm, e aparecem arredondados, ovais ou trilobados. Eles consistem de hifas Cruzes entrançadas em cimento acastanhado intersticial, consistindo de pigmento castanho-preto parecido com melanina . Histopatologia é um método rápido indicativo, bem como um processo vantajoso no pressuposto de um diagnóstico definitivo da doença de micetoma e inclui um relatório que descreve a apresentação morfológica dos agentes causadores. O agente causador ainda pode estar isolado do tecido ósseo envolvido . A descalcificação é um passo fundamental que é comumente alcançado para o exame histopatológico dos ossos . Os minerais nos ossos consistem em cálcio e fósforo, e os sais insolúveis compreendem mais de sessenta por cento do tecido ósseo . Estes minerais fornecem dureza óssea e são a causa de dificuldades durante o corte de tecidos usando microtomas rotativos . Esses tecidos devem ser tratados para extrair fosfato de cálcio através de um procedimento conhecido como descalcificação, tornando o tecido suficientemente delicado para ser cortado pelo microtoma. A descalcificação é realizada por ácidos que formam sais de cálcio solúveis ou agentes quelantes que se ligam a iões de cálcio. Os atuais métodos convencionais de descalcificação são caracterizados por processos laboriosos e a persistente falha da reação de coloração dos tecidos . No método convencional de descalcificação, os tecidos ósseos são colocados num fluido descalcificante à temperatura ambiente, com alterações da solução a intervalos regulares até o ponto final ser atingido. Descalcificação de micro-ondas é uma técnica inovadora em comparação com o método convencional . Neste processo, os tecidos sólidos são colocados na solução de descalcificação em um forno de microondas para durações periódicas com turnos usuais dos fluidos de descalcificação até o ponto final ser atingido. A radiação de microondas foi conduzida para acelerar o procedimento de descalcificação aproximadamente de dias a horas . O objetivo do presente estudo foi comparar o método convencional utilizado na descalcificação com o método de microondas modificado usando diferentes soluções de descalcificação. Foram testadas diferentes características, incluindo a velocidade de descalcificação e preservação morfológica e fúngica no tecido ósseo afectado pela infecção por Madurella mycetomatis.

2. Materiais e Métodos

Este é um experimentais estudo descritivo teve como objetivo comparar o convencional efectuar a descalcificação com micro-ondas avançada descalcificação com relação à morfologia do tecido afetado por mycetoma infecção usando haematoxylin e eosina, Gridley, e Grocott hexamina-prata manchas para uma completa identificação do Madurella mycetomatis causal organismos. Este estudo foi realizado no centro de pesquisa de Micetoma no Hospital da Universidade de Soba e na Faculdade de Ciências Médicas de laboratório, Universidade de Al Neelain. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os pacientes. Foram recolhidos 50 membros amputados afectados por micetoma. As biópsias ósseas foram cortadas com uma serra adequada em pedaços de 5 mm de espessura e depois fixadas em 10% de solução salina formal durante 48 horas. Foram lavados sob água corrente da torneira durante 30 minutos para remover o fixador.

2.1. O procedimento convencional de descalcificação

três pedaços de 5 mm de espessura de biópsias ósseas foram submergidos em três copos de 250 ml de Pyrex Squat, cada um contendo 100 ml de ácido clorídrico (HCl) a 5%, ácido nítrico aquoso a 5% (HNO3) e ácido etilenodiaminotetraacético a 10% (EDTA) colocados à temperatura ambiente (média 28°C), ver Quadro 1. O ponto final de descalcificação foi verificado utilizando o método do oxalato de cálcio para os dois descalcificadores ácidos (5% HNO3 e 5% HCl) após um intervalo de duas horas, como se segue:: 5 ml do fluido de descalcificação usado foi tomado e colocado em um tubo de ensaio, em seguida, foi adicionado papel litmus, e hidróxido de amônia foi adicionado gota a gota até que o papel litmus mudou, indicando que o líquido de descalcificação do pH alcalino estava limpo. Adicionaram-se 5 ml de solução saturada de oxalato de amónio quando a solução descalcificante se tornou turva, indicando a presença de cálcio no tecido ósseo, de modo que a solução descalcificante foi substituída por uma nova solução, e o processo foi repetido a cada 30 minutos até à conclusão do processo de descalcificação. Para EDTA, foram utilizados testes físicos descalcificadores nos quais se considerou que o processo de descalcificação tinha terminado quando o osso era facilmente penetrado por uma agulha. O tempo total descalcificado médio foi de 7 horas e 30 minutos, 8 horas e 120 horas para 5% de ácido nítrico, 5% HCl e 10% EDTA, respectivamente.

2.2. Procedimento de microondas

uma câmara de microondas (Midea Microwave 20L, 700W, Digital, EM720CFF) com uma placa rotativa imóvel foi usado. Um copo de vidro contendo 100 ml de água destilada foi pré-aquecido durante 5 segundos para aquecer o magnetron. Isto foi substituído por 100 ml de água destilada fresca e irradiada para manter a temperatura em torno de 41-43°C. Isto levou 15 segundos. O copo de vidro foi alocado em vários pontos do forno, irradiando-o para resolver a melhor localização da amostra durante a descalcificação de micro-ondas, uma vez que o forno de micro-ondas utilizado tinha um tempo constante, mas não uma temperatura constante. Três pedaços de 5 mm de espessura de biópsias ósseas foram imersos em 250 ml de copos de Pirex Squat contendo 100 ml de ácido clorídrico a 5% (HCl), ácido nítrico a 5% (HNO3) e EDTA a 10%. Em seguida, eles foram transferidos para o forno de microondas, e os espécimes foram irradiados por dez ciclos de dez segundos cada (a intervalos de 15 minutos) por um tempo total de 2-4 horas para descalcificadores ácidos (5% HNO3 e 5% HCl). A temperatura da solução de descalcificação foi mantida a cerca de 41-43°C. A solução de descalcificação e o ponto final de descalcificação foram verificados, e a solução de descalcificação foi repetidamente alterada até à conclusão da descalcificação. O ponto final de descalcificação foi verificado utilizando oxalato de cálcio e testes físicos como acima mencionado. A média do total descalcificada vezes foram 3 horas e 45 minutos, 5 horas e 30 minutos e 29 horas e 4 minutos para 5% de ácido nítrico, 5% HCl e 10% de EDTA, respectivamente. Após a descalcificação completa, os tecidos foram lavados usando água destilada e transferidos para 0,3% de solução de amônia por 5 minutos para neutralizar o ácido usado.

2.3. Processamento e coloração de tecidos

os espécimes foram submetidos a processamento automático de tecidos usando os seguintes protocolos: as biópsias ósseas foram colocadas em 10% de solução salina formal por uma hora. Em seguida, 50% de álcool uma hora, 70% de álcool uma hora, 90% de álcool uma hora, seguido de 100% de álcool três alterações cada duas horas, xileno duas alterações, cada uma por uma hora e meia, finalmente parafina cera duas alterações cada por duas horas. Os tecidos foram incorporados em blocos de parafina e foram seccionados para uma espessura de 5-6 µm usando um microtomo rotativo. As seções foram manchadas com a hematoxilina de Mayer, como descrito por Mayer em 1903, e a contra-resistência em cada uma era de 1% de eosina (HE) . A mancha de Gridley foi usada para demonstração de fungos, como descrito por Gridley em 1953); após a desparafinização e rehidratação, as seções tecidulares foram colocadas em ácido crômico a 2% durante 30 minutos. Eles foram então lavados bem com água da torneira, enxaguados com água destilada, e depois colocados no reagente de Schiff por 20 minutos. Foram então lavados em água corrente da torneira durante 10 minutos e enxaguados com 70% de etanol e depois com 95% de etanol. Eles foram contrastados com metal amarelo por um minuto e enxaguados bem com água destilada. Em seguida, foram desidratados em xileno e montados em distireno, um plastificante, e xileno (DPX). Depois, as secções foram examinadas ao microscópio . Além disso, o método Grocott Hexamina-prata para fungos, tal como descrito por Grocott em 1955, foi utilizado em que seções foram oxidadas com 4% de ácido crómico aquoso durante uma hora, lavadas em água durante alguns segundos, tratadas com 1% de metabissulfito de sódio durante um minuto, lavadas em água corrente da torneira durante 3 minutos, lavadas cuidadosamente em água destilada, colocadas em solução de prata de trabalho pré-aquecida num banho de água a 60°C durante 20 minutos, lavadas bem em água destilada, lavadas com água corrente da torneira durante 5 minutos, tingidas de verde durante 15 segundos, desidratadas e depuradas em água xileno e montado DPX, e finalmente examinado ao microscópio.

2.4. A avaliação dos resultados das secções

foi avaliada por um histopatologista especialista. A qualidade do procedimento de descalcificação e coloração, o resultado também foram avaliadas pela regra de ouro, e a qualidade de descalcificação foi avaliado pelos seguintes critérios: o tempo de descalcificação, morfológicas preservação da morfologia tecidual, e Madurella mycetomatis fungos por ELE; Gridley e Grocott metenamina de prata-coloração foi classificado de 1 a 4 (1: ruim, 2: feira, 3: bom, e 4: excelente) .

2.5. A análise estatística

foi realizada utilizando o programa SPSS. A ANOVA de Sentido Único foi utilizada para provar o efeito das três soluções descalcificantes na análise quantitativa da qualidade da secção e preservação dos fungos. O teste Kruskal–Wallis foi realizado para determinar se havia uma diferença significativa entre as soluções testadas para cada um dos parâmetros avaliados juntamente com os dois experimentos. As diferenças com foram interpretadas como sendo estatisticamente significativas.

3. Resultados

50 casos de Madurella mycetomatis com grãos negros foram incluídos no estudo. Os pés foram a região anatômica mais afetada em 48 casos (96%) e dois casos (4,0%) na mão. No que diz respeito ao tempo de descalcificação em diferentes experiências, entre as três soluções testadas, a descalcificação com 10% EDTA (pH 7.4) levou mais tempo para o método convencional (até 120 horas em comparação com 29 horas com o microondas), e o uso de uma solução ácido-descalcificante levou o menor tempo que variou de 8 horas a 3 horas para diferentes métodos de descalcificação. A qualidade da morfologia tecidular de diferentes tipos de solução de descalcificação utilizando o método de descalcificação por microondas em comparação com o método convencional com a coloração da hematoxilina e da eosina de Mayer no que diz respeito à aparência nuclear e citoplásmica obteve resultados variáveis. Além disso, 10% do osso EDTA-descalcificado parece ter um resultado significativamente superior (valor P utilizando o teste Qui-quadrado: 0,023) em comparação com 5% de HNO3 e 5% de HCl. O relatório de coloração excelente foi de 43 (86%) versus 32 (64%), 42 (84%) versus 18 (36%) e 33 (66%) versus 1 (2%), respectivamente. O Grocott metenamina de prata mancha método foi utilizado para demonstração da Madurella mycetomatis agente causador sobre a morfologia e o brilho dos fungos, e seções de tecido descalcificada por 10% de EDTA, 5% HNO3 e 5% HCl utilizando convencional e micro-ondas métodos mostrou-se significativamente melhor fúngicas morfologia (valor de P usando o teste qui-quadrado: 0.001) da seguinte maneira: 33 (66%) versus 32 (64%), 33 (66%) versus 39 (78%) e 22 (44%) contra 31 (62%), respectivamente. Outros fungos mancha usado para Madurella mycetomatis foi Gridley mancha a respeito de fungos morfologia e coloração de qualidade dos ossos descalcificada com 10% de EDTA, 5% HNO3 e 5% HCl utilizando o convencional e micro-ondas métodos que mostraram significativamente melhores resultados (valor de P usando o teste qui-quadrado: 0.003) da seguinte maneira: 43 (86%) versus 41 (82%), 32 (64%) versus 34 (68%), e 23 (46%) versus 35 (70%), respectivamente. Estes resultados estão resumidos no quadro 2. A figura 1 mostra os resultados de coloração utilizando diferentes agentes e condições de descalcificação.

Figura 1

Demonstração de resultados de coloração utilizando diferentes descalcificação agentes e condições.

4. Discussion

The histopatological identification of the causative agent of Madurella mycetomatis is well established as it is the gold standard procedure; however, hard tissue and bone require special decalcification to preserve the tissue structure and causative agent morphology. Os agentes causadores podem ser identificados usando hematoxilina e eosina (HE) e manchas especiais de fungos, então o osso requer um protocolo padrão de descalcificação que preserva tecido, morfologia do agente causador e capacidade de coloração. A descalcificação óssea é uma técnica tediosa. Requer semanas, e a conservação da configuração dos tecidos depende da excelência e da velocidade do procedimento de descalcificação. Um novo processo usando um forno de microondas foi realizado para acelerar o processo de descalcificação . A seleção do agente e da maneira descalcificante é basicamente determinada pela seriedade do método , e os possíveis usos da energia de microondas em técnicas histológicas foram documentados pela primeira vez por Mayers em 1970. This system of nonionizing emission method thought to speedup decalcification process . A cinética molecular causa então a produção de mudança de energia, que dura até a radiação parar . Neste estudo, os tempos de descalcificação relatados para a descalcificação com microondas e o procedimento convencional de descalcificação foram de 29 e 120 horas com 10% EDTA (pH 7.4), três horas e sete horas com 5% de ácido nítrico, e cinco e oito horas com 5% HCl, respectivamente. É evidente que o método de descalcificação por microondas para o tecido ósseo afectado pela infecção por micetoma foi significativamente mais rápido do que o método convencional. Além disso, 5% de ácido nítrico tinha capacidade de descalcificação mais rápida seguida de 5% de ácido clorídrico e depois EDTA (pH 7.4) para ambos os métodos. Pitol et al. usou uma panela de microondas para remover o cálcio do osso do rato por 8,5% de solução EDTA e mostrou uma diminuição do período de ensaio de 45 dias no processo convencional para 48 h no processo assistido por microondas. Neste trabalho, a solução EDTA de 10% levou 120 horas no método convencional e 29 horas usando microondas para alcançar a descalcificação completa do tecido ósseo afetado com infecção por micetoma. A concentração de EDTA na nossa experiência foi mais do que Pitol et al.o estudo. Além das diferenças de tamanho, espessura e tipos de osso, estas podem ser explicações possíveis para os aumentos no tempo de descalcificação em Pitol et al.o estudo que foi reduzido no nosso cenário. Além disso, a descalcificação do osso afectado pela infecção por micetoma com o método convencional utilizando ácido nítrico a 5% demorou sete horas, enquanto o método do forno de microondas demorou três horas. Resultados comparáveis foram alcançados por Balaton e Loget . Além disso, nesta pesquisa, os tempos de descalcificação foram reduzidos a partir de outros estudos. A descalcificação times convencional e micro-ondas métodos variou de um dia e quatro horas a 5 dias e são considerados baixos em comparação com outros estudos em roedores de ossos, que têm relatado vezes entre 2 e 7 dias com ácido descalcificação soluções e 10% de EDTA (pH 7.4), respectivamente . Shibata e seu grupo relataram tempos de descalcificação quase semelhantes que variaram de 1 dia a 7 dias com 10% de HCl, 10% de ácido nítrico e 10% EDTA. Contudo, utilizaram descalcificantes ácidos com concentrações mais elevadas . Uma et al. avaliou os efeitos de quatro fluidos descalcificantes diferentes utilizando descalcificação por micro-ondas no osso do rato e comunicou 1 a 1,5 dias para 5% de ácido nítrico e 7% de HCl/2% EDTA. No entanto, 10% EDTA levou 14 a 26 dias de acordo com o tipo de osso . Nestes estudos, o tipo ósseo, a natureza e o tamanho variavam e diferiam dos analisados aqui. O procedimento de descalcificação foi uma razão fundamental para a superioridade da seção de tecido e precisão da coloração. Philipp et al. (2019) described that the decalcification method causes significant morphological changes that alter the protein structure and affect staining ability of the tissue . No nosso estudo, o osso foi tratado com 5% de ácido nítrico com o método manual de rotina, e houve inchaço nos tecidos moles e perda de coloração nuclear e fúngica em comparação com a descalcificação assistida por microondas. Os agentes ácido-descalcificantes geralmente perturbam a constância dos ossos e dos tecidos moles. Estes efeitos especiais em ácido nítrico a 5% devem-se ao período tomado e à acidez da solução. Assim, a descalcificação mais rápida causará maior lesão e maiores efeitos em H&E e coloração especial fúngica. Vários fungos podem ser demonstrados com uma secção histológica usando manchas histoquímicas como a mancha de metenamina-prata de Grocott (GMS) e/ou a mancha de Gridley (GS). Alguns fungos podem ser exatamente demonstrados no tecido com base em estruturas morfológicas; no entanto, a eficácia do reconhecimento tendeu a diminuir após fixação prolongada e descalcificação usando métodos convencionais . Neste estudo, a descalcificação assistida por micro-ondas deu coloração superior em comparação com o método convencional de morfologia usando h&E e coloração especial fúngica, onde 10% EDTA foi a solução que melhor preservou estruturas de tecidos e capacidade de coloração fúngica, apesar de demorar muito tempo para a descalcificação.

5. Conclusion and Recommendations

Decalcification enhanced by the use of a microwave oven is a new technique for decalcification. Esta técnica foi investigada no tecido ósseo afectado pela infecção por Madurella mycetomatis utilizando 10% EDTA, 5% ácido nítrico e 5% ácido clorídrico como fluidos descalcificantes. Isto foi comparado com a descalcificação convencional em temperaturas ambientes para determinar a velocidade de descalcificação e morfologia tecidular usando a coloração hematoxilina e de eosina de Mayer para a estrutura óssea e as manchas de Grocott e Gridley para morfologia fúngica. Melhores resultados foram alcançados em comparação com o método convencional tanto em morfologia celular e esporos de fungos e hifas com diminuição do brilho dos fungos à temperatura ambiente. Este achado pode ajudar a desenvolver protocolos adequados para a análise do tecido ósseo afectado com a infecção por micetoma.

6. Limitations of the Present Study

A larger sample size would have given more conclusive results. Além disso, é provável que os tempos de descalcificação sejam diferentes se forem utilizados pesos ósseos diferentes e amostras de ossos diferentes das mãos, uma vez que o tempo de descalcificação depende do tamanho e da densidade estrutural do tecido duro. Finalmente, uma vez que usamos um forno de microondas doméstico, nossas gravações de temperatura podem ter sido apenas aproximadas.

disponibilidade de dados

os conjuntos de dados gerados durante o estudo atual estão disponíveis do autor correspondente, a pedido razoável.

aprovação ética

este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of the Faculty of Medical Laboratory Science, University of Al Neelain.

conflitos de interesses

o autor declara que não existem conflitos de interesses.

Agradecimentos

O autor deseja expressar sua gratidão à equipe do Mycetoma Centro de Investigação da Universidade de Cartum, Cartum, no Sudão, e agradecimento especial aos professores Ahmed Hassan Fahal e Ahmed Mohammed El Hassan, o emérito professor de patologia, por sua assistência.

materiais suplementares

os materiais e reagentes utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão incluídos nas informações suplementares. (Matérias Suplementares)