ABSTRACT
Influenza virus neuraminidase (NA) desempenha um papel essencial na libertação e propagação de viriões descendentes, após o ciclo de replicação viral intracelular. Para testar se a NA também poderia facilitar a entrada do vírus nas células, infectámos culturas de epitélio das vias aéreas humanas com vírus da gripe humana e aviária na presença do inibidor da na, oseltamivir carboxilato. 20 a 500 vezes menos células infectaram-se em culturas tratadas com fármaco versus culturas não tratadas (P < 0, 0001) 7 h após a aplicação do vírus, indicando que o fármaco suprimiu o início da infecção. Estes dados demonstram que as NA virais desempenham um papel precoce na infecção, e fornecem uma fundamentação adicional para o uso profiláctico de inibidores da NA.
acredita-se que a principal função da neuraminidase viral (NA) Está na fase final da infecção quando na cliva ácido siálico a partir da superfície celular e viriões descendentes que facilitam a libertação do vírus a partir das células infectadas (1, 2). Sabe-se menos sobre as funções NA durante a entrada do vírus na célula. Há muito tempo que se assume que NA promove o acesso do vírus às células alvo nas vias aéreas pela degradação do muco (3). No entanto, este conceito nunca foi formalmente provado devido à falta de um sistema experimental adequado. Além disso, foram comunicados alguns elementos de prova que argumentam contra o papel das NA nas fases iniciais da infecção (analisados na referência 2).Para abordar esta questão, estudámos os efeitos do inibidor da na, carboxilato de oseltamivir (OC) (9) na entrada do vírus influenza em culturas de epitélio das vias aéreas humanas. Células epiteliais traqueobronquiais humanas primárias (HTBE; Clonética) e células epiteliais nasais primárias (PromoCell GmbH) foram cultivadas em suportes de membrana (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) na interface ar-líquido no Factor de crescimento sem soro e no meio com suplementação hormonal (6, 8). Culturas totalmente diferenciadas de 4 a 8 semanas de idade foram usadas para todas as experiências. Estas culturas eram pseudostratificadas e polarizadas; continham células basais, ciliadas e secreções muco; e muito semelhantes ao epitélio das vias aéreas humanas in vivo (Fig. 1). OC (1 µM, se não for indicado em contrário) foi adicionado às suspensões de vírus e aos compartimentos basolaterais das culturas pouco antes de infectar duas culturas replicadas do lado apical. Duas culturas de controlo foram infectadas na ausência de inibidores. Uma hora após a infecção, removemos o inóculo do vírus e incubamos as culturas na interface ar-líquido para mais 6 h para permitir a replicação do vírus intracelular. As culturas foram então fixadas, e as células infectadas foram identificadas através da coloração com anti-soros policlonais a vírus inteiros, seguida de anticorpos secundários marcados com peroxidase correspondentes (Dianova) e substrato de aminoetilcarbazol (Sigma). A coloração positiva indica entrada bem sucedida do vírus na célula. As culturas foram analisadas en face a uma ampliação de ×300 (Olympus IMT-2). Um número total de células que expressam o antigénio viral foi contado no segmento epitelial que incluiu todas as observações microscópicas consecutivas (0,28 Por 0,42 mm) ao longo do diâmetro da cultura (área de superfície do segmento, 3 mm2; número de células por segmento, cerca de 30.000). Quatro segmentos por cultura foram contados girando a cultura no sentido horário por 45o. os dados para oito segmentos de duas culturas replicadas foram calculados em média.
em duas experiências que utilizaram culturas HTBE, o vírus humano a/Memphis/14/96 (H1N1) infectou 22 e 65 vezes menos células na presença de inibidores da NA comparativamente aos controlos (Fig. 2; Tabela 1) (P < 0, 0001). Os vírus a/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) de uma ave aquática Selvagem e a/Turkey/Italy/2379 / 99 (H7N1) de aves de capoeira domésticas também foram marcadamente sensíveis à OC nestas culturas. Em culturas epiteliais nasais, a OC reduziu a infecção pelo vírus humano e pato 120 E 520 vezes, respectivamente. Estes resultados indicaram que a inibição da NA viral suprime o início da infecção viral.
a / Chicken / Germany/R28 / 03 (H7N7) pertence à linhagem do vírus da gripe aviária de alta patogenicidade que provocou um surto de peste aviária em explorações avícolas comerciais nos Países Baixos, na Bélgica e na Alemanha em 2003. Estes vírus foram transmitidos a pelo menos 89 humanos, a maioria dos quais com conjuntivite, mas também ocorreu um caso fatal de pneumonia (5). A infecção pelo vírus da galinha H7N7 em culturas HTBE diminuiu 140 e 40 vezes na presença de 1 e 0,1 µM OC, respectivamente. Estas concentrações representaram concentrações típicas máximas e mínimas de fármaco atingidas no ser humano após a administração de 75 mg de fosfato de oseltamivir, a dose recomendada para profilaxia (9).
Para confirmar a hipótese de que a inibição de infecção em nossos experimentos foi diretamente relacionado com a inibição viral NA atividade enzimática, usamos humanos, A/Sydney/5/97-como o vírus a (H3N2) e sua oseltamivir-resistente mutante com um R292K substituição no NA, o que torna a agência de 9.000 vezes menos sensível a inibição por OC (4). Consistente com a hipótese, o vírus humano de origem foi fortemente inibido pela OC, enquanto que apenas foi observado um nível marginal de inibição do mutante resistente quando ambos os vírus foram testados na mesma experiência em culturas HTBE (Tabela 1). Até à data, não se encontrava disponível um ensaio adequado de cultura celular para a monitorização da resistência do vírus influenza aos inibidores da NA devido ao desfasamento entre os receptores do ácido siálico nos seres humanos e nas linhas celulares convencionais de laboratório (9, 11). Os nossos resultados sugerem que culturas diferenciadas de epitélio das vias aéreas humanas podem ser um sistema de cultura celular adequado para a detecção da resistência do vírus influenza aos inibidores da NA.
finalmente, usando a droga sensível a/Sydney/5/97-tal como o vírus, testámos a inibição da infecção por OC adicionada em momentos diferentes após a inoculação do vírus. Enquanto 47 vezes menos células foram infectadas quando o fármaco foi adicionado pouco antes da infecção, um atraso de 1-h para além da OC resultou numa inibição de apenas 1, 5 vezes em relação ao controlo não tratado (Quadro 1). Se o fármaco foi adicionado 4 h após a inoculação do vírus, não foi observada inibição estatisticamente significativa. Estes dados sugerem que a OC afectou as primeiras fases da infecção antes da replicação do vírus.
em resumo, nós fornecemos aqui pela primeira vez evidências experimentais diretas para o papel essencial de NA Na Na fase da invasão do vírus do epitélio ciliado das vias aéreas humanas. A função NA nesta fase é mais provável a remoção de receptores de chamariz nas mucinas, cílios e glicocalix celulares, forte ligação a cada um dos quais impediria o acesso do vírus a receptores funcionais na membrana superficial das células alvo. No entanto, outras funções NA—por exemplo, a promoção da fusão mediada pela hemaglutinina (7)-não podem ser excluídas, sendo necessários estudos adicionais para especificar os mecanismos exactos pelos quais a NA promove a entrada do vírus nas células epiteliais das vias aéreas.
sem vacina ainda disponível contra os vírus da gripe aviária de alta patogenicidade h7n7 e H5N1, os medicamentos antivirais continuam a ser a única opção para combater a gripe aviária (10). Em comparação com outros agentes anti-influenza, Os inibidores da NA são bem tolerados e eficazes contra todas as estirpes dos vírus influenza A e B. Tem havido pouca evidência do surgimento de resistência viral, e a infecciosidade dos vírus mutantes é geralmente comprometida (9, 11). A capacidade dos inibidores da NA para suprimir a infecção antes da entrada do vírus nas células sublinha o seu elevado potencial para medidas preventivas. Em particular, os nossos dados fornecem a base científica para apoiar a utilização profiláctica destes compostos para pessoas com elevado risco de infecção por vírus da gripe aviária.
