Avanços em Genômica de Teste-o Que você Precisa Saber

Avanços em Genômica de Teste-o Que você Precisa Saber

pelo Dr. C. H. Weaver M. D. atualizado 9/1/2018

P: o Que é genoma teste?

A: Genomic testing looks at a group of genes and their varying levels of expression. Esta expressão ou atividade genética pode caracterizar como os genes interagem uns com os outros e prever o comportamento de certos tecidos dentro do corpo. Isto está em contraste com o teste genético, que olha para uma mudança específica dentro de um cromossomo ou gene individual, muitas vezes como parte de uma característica hereditária.

Q: Qual é o papel dos testes genómicos num diagnóstico de cancro?
A: o teste genômico pode fornecer informações sobre o prognóstico de um paciente com base na expressão genética dentro do tecido canceroso de um indivíduo e muitas vezes pode prever se certa terapia (como a quimioterapia) será de benefício.

Q: em que ponto do processo de diagnóstico ocorre o teste genômico?
A: Testes genômicos podem ocorrer a qualquer momento após uma amostra de tecido (biópsia ou ressecção) de câncer foi adquirida.Que perguntas devo fazer à minha equipa de cuidados de saúde sobre os testes genómicos?
A: seguem-se as perguntas principais a fazer ao seu prestador de cuidados de saúde.

• está disponível o teste genômico para o tipo de câncer que eu tenho, para ajudar a determinar o meu prognóstico global?
• os resultados deste teste terão o potencial de alterar o seu tratamento do cancro? Especificamente:
  • o teste será capaz de me dizer se certas terapias serão benéficas no meu tratamento?
• teve resultados positivos ao utilizar este teste com outros pacientes?Este teste está coberto pelo meu plano de seguro? (This type of testing can run in the thousands of dollars, though many plans cover the tests without an out-of-pocket expense.)

P: existem tipos específicos de câncer para os quais o papel dos testes genômicos é especialmente significativo?

A: Existem três tipos de pacientes com câncer para quem genómico de teste pode ser particularmente vantajoso:

• Pacientes com receptor de estrogênio positivo de câncer de mama que ainda não se espalhou para os linfonodos (em fase inicial de câncer de mama) pode ter um prognóstico que é difícil prever por biópsia de tecido sozinho. O teste genômico pode não só ajudar a fornecer informações prognósticas (ou seja, a sobrevivência prevista de 10 anos), mas também pode prever se a quimioterapia será de algum benefício significativo, permitindo que um paciente evite a toxicidade da quimioterapia quando possível.
• os doentes com certos tipos de cancro do cólon também podem beneficiar de testes genómicos em termos de determinação do prognóstico, previsão do benefício da quimioterapia e selecção da quimioterapia (determinação dos agentes químicos que serão os mais benéficos).
• Pacientes com câncer que se espalhou para outras partes do corpo (doença metastática) ou que tenha retornado localmente (apesar de a cirurgia e/ou quimioterapia) podem sofrer genómico de teste que analisa a expressão através de uma ampla variedade de genes, incluindo os que não são normalmente associados com o site original do câncer. Este tipo de teste genômico pode identificar certos genes que podem potencialmente ser um alvo para a terapia que inicialmente não foi considerada. Uma mudança para uma terapia orientada teria o potencial de melhorar marcadamente a sobrevivência.

o papel emergente da Genómica no diagnóstico e Monitorização do cancro

visão geral

o cancro é o resultado de anomalias genéticas que afectam a função de determinados genes. Os Genes determinam a forma, função e padrões de crescimento das células. Aqueles que aceleram ou suprimem o crescimento estão frequentemente envolvidos no câncer. Por exemplo, muitos cancros têm uma anormalidade em um gene que é responsável por estimular o crescimento celular e/ou o gene que normalmente previne o câncer não está funcionando corretamente. Ambas as anomalias genéticas podem resultar em crescimento celular descontrolado e excessivo, o traço característico do cancro. Testes genômicos, ou ensaios como eles são chamados por cientistas, são uma ferramenta para identificar os genes específicos em um câncer que são anormais ou não estão funcionando corretamente. Em essência, isso é como identificar a assinatura genética ou impressão digital de um câncer particular.

os ensaios genómicos são diferentes dos ensaios genéticos. Testes genéticos são tipicamente usados para determinar se um indivíduo saudável tem uma característica hereditária (gene) que os predispõe ao desenvolvimento de câncer. Os testes genômicos avaliam os genes em uma amostra de tecido doente de um paciente que já foi diagnosticado com câncer. Desta forma, os genes que sofreram mutações, ou que desenvolveram funções anormais, são identificados, além dos que podem ter sido herdados.

os testes genómicos podem ajudar os médicos a:

• Determinar o prognóstico do paciente (potencial de resultado)
• Determinar se um câncer é agressivo ou de crescimento rápido ou lento crescimento
• Escolher o tratamento mais eficaz para cada indivíduo câncer
• Monitor de pacientes que são submetidos a tratamento para determinar se o tratamento está a funcionar
• Monitor de pacientes que estão em remissão para pegar um potencial de progressão da doença cedo, quando ele é mais tratável

Talvez a maior promessa de genômica de teste é o seu potencial para individualizar o tratamento. Isto significa que os pacientes com condições mais graves podem ser identificados e oferecidos terapias agressivas e inovadoras que podem prolongar a sua vida, enquanto os pacientes que são diagnosticados com uma condição menos grave podem ser poupados tratamentos desnecessários. Por exemplo, algumas mulheres com cancro da mama negativo em nódulos Irão recair após serem tratadas apenas com cirurgia. Foi demonstrado que os testes genómicos diferenciam entre quais doentes com cancro da mama com nódulos negativos têm maior probabilidade de recidiva e, por conseguinte, beneficiam de quimioterapia adicional e quais os doentes que podem não necessitar de quimioterapia.

para apreciar como a Ciência da genética é aplicada ao diagnóstico e monitorização do cancro, é útil ter uma compreensão dos princípios básicos da genética. Isso inclui saber o que são DNA, cromossomos e genes, como eles funcionam, e como a informação contida no DNA é transformada, através da expressão do gene, em estruturas específicas que ditam as funções de uma célula.

com este conhecimento de fundo, é possível compreender a promessa de testes para detecção de anomalias genéticas, tais como:

• fluorescência em hibridização in situ (FISH)
• reacção em cadeia da polimerase (PCR)
• transcrição reversa PCR
• tecnologia de Microarray
• Proteómica sérica

princípios básicos da Genética

a importância da genética na hereditariedade é bem conhecida; no entanto, o papel que desempenha na genética no controle da estrutura e função das células pode ser ainda mais crítico para um organismo individual. A hereditariedade assegura que os seres humanos e todas as espécies são capazes de reproduzir e perpetuar seus traços únicos e direcionar como as células são construídas, o trabalho que fazem, e como elas crescem é necessário para garantir que um organismo sobreviverá para se reproduzir. Uma compreensão deste papel crítico que o ADN e os genes têm na determinação da vida minuto-a-minuto de uma célula também é importante para compreender como a genética está envolvida no cancro.

DNA: A informação genética de um organismo inteiro está contido no núcleo de cada célula na forma de ácido desoxirribonucleico, comumente conhecido como DNA. O DNA é uma molécula helicoidal de cadeia dupla (enrolada). Cada cadeia é composta de uma espinha dorsal estrutural mais uma sequência de compostos contendo nitrogênio chamados bases azotadas, que pode ser pensado como o alfabeto da genética. Existem quatro bases: adenina, guanina, timina e citosina. Os dois fios estão ligados nas bases.

o código genético, ou a informação genética que controla a estrutura e a função da célula, está contido na sequência de bases. A sequência de base eventualmente controla a sequência de aminoácidos que são conectados para fazer uma molécula de proteína. Sequências diferentes fazem proteínas diferentes. As proteínas que são sintetizadas numa célula determinam a estrutura e a função dessa célula.Cromossomas

cromossomas: o ADN é embalado num número específico de unidades chamadas cromossomas. Os humanos têm 46 cromossomas em cada célula. Na maioria das vezes, os cromossomos são embalados firmemente em torno de proteínas no núcleo da célula, de modo que eles não podem ser vistos. No entanto, nos estágios da vida da célula pouco antes da divisão celular, os cromossomos tornam-se visíveis com um microscópio de luz. Eles aparecem como um “H” maiúsculo com quatro comprimentos de DNA enrolado Unidos por uma proteína como a “Cruz”do ” H”.

Genes: o DNA é organizado em genes, que são longos segmentos de DNA que incluem regiões que contêm códigos de proteínas chamadas éxons, bem como a não-codificantes chamadas de íntrons. Os Genes são definidos como a unidade básica da hereditariedade porque são passados à descendência e depois replicados e passados para células individuais durante a divisão celular. A replicação envolve o uso de ambas as cadeias de DNA como modelos para sintetizar o DNA complementar (cDNA), que é uma cadeia correspondente. O resultado é duas cópias idênticas de DNA para cada célula após a divisão celular estar completa. Em condições normais, a estrutura do DNA e, portanto, dos genes, permanece relativamente constante através da replicação e divisão celular.

expressão genética: a informação genética contida nos genes é traduzida para a estrutura celular e função através de um processo chamado expressão genética. Genes podem ser pensados como códigos, ou receitas, para fazer proteínas. As proteínas são o componente básico da estrutura celular e função. Quando um gene é “expresso”, as proteínas para as quais ele codifica estão sendo ativamente construídas na célula e a função que essas proteínas servem está sendo realizada. Por exemplo, quando o gene HER-2/neu é expresso no câncer de mama, há mais receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFRs) presentes, que são proteínas na superfície celular para as quais o HER-2/neu codifica. Além disso, a função do EGFR é estimular o crescimento celular; assim, uma célula que está expressando HER-2/neu tem muitos EGFRs e está crescendo ativamente.

a expressão genética ocorre através de um sistema complexo que envolve os seguintes passos:

• separação temporária das duas cadeias da molécula de ADN num gene particular.
• transcrição do segmento de ADN, que é a síntese de uma cópia de cadeia única da sequência de ADN que é exposta; esta cópia é chamada ARN mensageiro (ARNm).
• síntese de proteínas, ou construção de novas proteínas na célula, com base na informação contida no ARNm.

anomalias genéticas: Anomalias genéticas são alterações no DNA de uma célula que podem ocorrer por acaso ou devido a uma influência ambiental. Estas alterações dão à célula afectada alguma vantagem sobre as células normais que as ajudam a crescer. Como resultado, a célula é capaz de se dividir rapidamente, tornando-se um crescimento do câncer. No entanto, esta vantagem de crescimento só beneficia a célula individual, e não necessariamente todo o organismo (humano).

os tipos de anomalias genéticas incluem:

translocações-os locais de mudança de um gene de um cromossoma com um gene de outro cromossoma; este tipo de anomalia define as muitas leucemias diferentes

Delecções—falta um gene ou sequência de nucleótidos no ADN

polimorfismos—variações na sequência de nucleótidos

testes para detecção de anomalias genéticas

uma variedade de novos testes laboratoriais podem detectar anomalias genéticas. Encontrar uma mutação causadora de doenças num gene pode confirmar um diagnóstico suspeito de cancro ou identificar os predispostos a certos cancros. Algumas destas técnicas que são atualmente utilizadas no ambiente clínico incluem:

• hibridização in situ por Fluorescência (FISH)
• reação em cadeia da Polimerase (PCR)
• transcrição Reversa PCR

Além disso, as seguintes técnicas de laboratório estão sendo usados na pesquisa do câncer e podem estar disponíveis para uso clínico no futuro:

• Microarray

hibridização in situ por Fluorescência (FISH)

PEIXE é um laboratório de técnica que é usada para detectar anomalias genéticas na célula única e um único gene, como por exemplo numérico anormalidades (ganhos e perdas de nucleotídeos), e translocações (changing places de um gene ou segmento de genes de um cromossomo com gene ou de um segmento sobre o outro cromossomo). Estas anomalias desempenham um papel no desenvolvimento e progressão de alguns cancros, tais como leucemias e linfomas1.

como funciona o peixe? O peixe é realizado em células de amostra cujo ADN se desfez de modo a que os cromossomas individuais sejam visíveis. Isto acontece durante as fases celulares pouco antes da divisão celular, chamada metafase ou interfase. O ADN da amostra é primeiro desnaturado através do calor e da formamida química, de modo a que as cadeias individuais se separem, expondo a sequência de base. Em seguida, sequências específicas de DNA, chamadas sondas, que são ligadas a flúor colorido são incubadas, ou combinadas, com a amostra de DNA. As sondas hibridizam (conectam) com o DNA nos cromossomos que é o cumprimento à sequência base na sonda. A presença ou ausência de fluorescência do ADN e da sonda hibridizados é visível com um microscópio especializado e indica se a sequência de ADN em questão está presente na amostra. Além disso, técnicas de peixe especializadas podem ser usadas para detectar translocações, inversões e amplificações que estão envolvidas no câncer.2

peixe com cancro da mama e do ovário: uma utilização comum se o peixe for para determinar se as doentes com cancro da mama e do ovário sobre-expressam o HER2/neu oncogene, um gene que está frequentemente envolvido no cancro. HER2 / neu carrega o código genético para o receptor HER2, uma proteína na superfície de algumas células cancerosas. O HER2 liga-se aos factores de crescimento no sangue, estimulando assim o crescimento das células cancerígenas.

HER2/neu é amplificado em aproximadamente 20% a 30% dos cancros da mama e do ovário e esta amplificação e / ou sobre-expressão indica um mau prognóstico.3 FISH can be used to Observer whether the HER2/neu oncogene is sending multiple signals at the level of the individual cells, which indicates gene amplification.

peixes em cancros hematológicos (sanguíneos): Os peixes também podem ser usados para diagnosticar e gerenciar várias doenças malignas hematológicas. A anormalidade genética que subjaz a muitas doenças hematológicas malignas é a translocação cromossômica, ou a mudança de lugares do gene de um cromossomo com um gene em outro cromossomo.

reacção em cadeia da polimerase (PCR)

PCR é um método laboratorial in vitro que é útil para o teste genético de doenças e detecção de uma doença residual mínima, que é uma pequena quantidade de doença deixada após o tratamento que pode levar à recorrência e é tipicamente indetectável com outras técnicas. Este procedimento amplifica um segmento de DNA de uma pequena amostra, tornando-o detectável. Com a PCR, sequências relativamente pequenas de ADN conhecido podem ser replicadas em milhões de cópias ao longo de um curto período de tempo.

como funciona a PCR? Este método requer quatro componentes principais: 1) a amostra de DNA, 2) um amplo fornecimento de nucleotídeos, 3) termoestável polimerase enzima que é responsável por copiar o DNA, e 4) os iniciadores, curta seqüência de nucleotídeos que se encontram em ambos os lados do fragmento de DNA de interesse e sinal de polimerase para iniciar a replicação do DNA específico do segmento.

PCR é um processo de três etapas, cada um ocorrendo a uma temperatura diferente. O ADN da amostra é aquecido pela primeira vez a aproximadamente 90ºC, a fim de separar as duas cadeias de ADN emparelhadas. Uma vez separado, arrefece-se até uma temperatura que permite aos iniciadores hibridizarem com a sua sequência complementar no ADN-alvo, aproximadamente 40ºC. Por último, a replicação do ADN ocorre a aproximadamente 70ºC, a temperatura à qual a ADN polimerase é mais activa. Este processo é repetido 20 a 30 vezes, resultando em aproximadamente 1 milhão de vezes de amplificação do fragmento de DNA de interesse.4

transcrição Reversa PCR

transcrição Reversa (RT-PCR é uma técnica que detecta o grau em que os genes são expressos. Processos complicados controlam qual segmento de DNA separa, é transcrito (copiado) em Rnam, e então expresso como proteínas na célula. Nem todos os genes são transcritos e depois expressos de forma igual. Devido a muitos controles na célula, alguns genes são sobre-expressos, o que significa que eles são transcritos e expressos a uma taxa mais elevada do que o normal, enquanto outros genes são agora expressos, ou “desligados” de modo que certas funções não se manifestam na célula.

como funciona a RT-PCR? RT-PCR usa os mesmos passos que PCR para amplificar um segmento de DNA, mas a amostra é uma cópia complementar de mRNA. Começando pelo ARNm, este teste mede apenas o ADN que é expresso, tornando possível determinar o grau em que determinados genes são expressos. As utilizações recentes de RT-PCR na Oncologia Clínica incluem a detecção de micrometastases dos gânglios linfáticos no cancro da próstata e metástases ósseas no cancro da mama.5

RT-PCR no cancro da mama: o Oncotipo DX™ do teste do cancro da mama utiliza RT-PCR para determinar o risco individual de recorrência em mulheres com cancro da mama com receptor estrogénio negativo para nódulos (ER)-positivo. Este teste avalia a expressão de 21 genes no câncer de mama. A sobreexpressão de alguns destes genes indica um prognóstico pior, enquanto a expressão de outros pode indicar um prognóstico melhor. A expressão de todos os 21 genes é usada para calcular uma ” pontuação de recorrência™”, ou a probabilidade de que o câncer vai reaparecer. Um grande ensaio clínico mostrou que a recorrência Score™ foi mais eficaz para prever o prognóstico de mulheres com câncer de mama nodo-negativo, ER-positivo do que as medidas padrão, tais como Idade do paciente, Tamanho do câncer e estágio do câncer.6

estratégias para melhorar a detecção de anomalias genéticas

vários métodos de detecção de anomalias genéticas estão sendo utilizados para pesquisa de câncer. Embora ainda não sejam usados rotineiramente no ambiente clínico, os seguintes parecem promissores e podem ser usados no futuro para diagnosticar, testar e monitorar o câncer.

Microarrays: a análise de Microarray é uma técnica que combina biologia com ciência da computação para gerar um perfil genético para uma dada amostra de tecido que reflete a atividade de milhares de genes. Esta tecnologia tem vantagens sobre o peixe ou PCR porque, em uma única análise, pode avaliar a expressão de todos os genes que podem estar envolvidos em um câncer, em vez de apenas alguns. Ao mostrar graficamente como todos os genes estão envolvidos em um câncer, microarray pode gerar uma “assinatura genética” para um câncer particular. Isso torna a identificação do subtipo de câncer mais precisa. A capacidade de tirar uma foto da assinatura genética de um câncer pode levar a uma melhor compreensão de como esse câncer se desenvolve e como projetar tratamento individualizado.

como funcionam os microarrays? Enquanto diferentes métodos de microarray são utilizados, cada um consiste em cinco etapas básicas:

• Preparação da amostra
• Combinando o exemplo com o chip de computador
• Digitalização de chips de computador
• Normalização
• Computador a análise dos resultados.

preparação da amostra: na fase inicial, o cDNA é sintetizado a partir do RNA por transcrição reversa (lembre-se que a transcrição envolve a cópia do DNA para fazer o RNA, de modo que a transcrição reversa está gerando DNA a partir do RNA) a partir do RNA que foi extraído tanto de um teste como de uma amostra de referência. Os segmentos de DNA da amostra são rotulados com fluorocromos, ou produtos químicos radioativos, de modo que eles podem ser detectados depois de se combinarem com o chip de computador.

combinando a amostra com o chip de computador: em seguida, a amostra é combinada com o chip de computador, que é uma grade retangular de pontos. Cada ponto tem muitas cópias de uma sequência de ADN em particular. Estas sequências são derivadas de bases de dados públicas de sequências de ADN que foram geradas através do Projecto do Genoma Humano, o esforço científico que identificou virtualmente todas as sequências de ADN na espécie humana.

quando a amostra é adicionada ao chip de computador, um processo chamado hibridização ocorre. Isto significa que o segmento de DNA de amostra se liga (hibrides) ao segmento no chip de computador que tem a sequência complementar exata dos nucleótidos (os quatro compostos que são o alfabeto da genética).Uma vez concluída a hibridação, os scanners são usados para detectar a fluorescência e criar uma imagem digital que reflete onde o DNA da amostra combinada com manchas no chip de microarray.

normalização: Como a intensidade do sinal bruto pode variar entre chips individuais de muitos pacientes ou experimentos, a intensidade do chip individual deve ser ajustada para um padrão comum, ou normalizado. Por exemplo, subtração do ruído de fundo é um método comum de normalização que é aplicado a todas as amostras. A normalização torna possível comparar perfis de expressão genética de muitos pacientes ou experimentos.

Computer analysis: The final step in a microarray experiment is computer analysis. Os milhares de pontos de dados brutos que resultam de análises de microarray são essencialmente ininteligíveis, a menos que sejam avaliados no contexto de outros resultados. Por exemplo, o perfil de expressão genética (resultados de microarray) do tecido normal e doente pode ser comparado para identificar genes que variam em sua expressão e também identificar um padrão (perfil) que pode indicar uma classe distinta ou estágio de doença.7

Microarrays em Oncologia: A análise Microarray tem contribuído para a oncologia, aumentando a compreensão da base genética de vários tipos de câncer, incluindo linfoma não-Hodgkin de células B (BCNHL), leucemia aguda e câncer de mama.

• conhecimentos consideráveis sobre a patologia da BCNHL foram obtidos comparando padrões de expressão genética de tecidos doentes e normais. Duas categorias diferentes de doenças exibem perfis de expressão genética distintos. Os Microarrays ajudaram a estabelecer esses perfis de expressão e, no futuro, podem ajudar a classificar com precisão novos casos de BCNHL.
• no caso de leucemia aguda, os microarrays ajudaram a estabelecer padrões de expressão genética distintos que ajudaram a diferenciar leucemia linfocítica aguda (LLA) e leucemia mielóide aguda (LMA). Usando estes perfis, 29 de 34 novos casos de leucemia foram corretamente previstos.
• além disso, os microarrays ajudaram a identificar dois perfis de expressão genética distintos no cancro da mama, BCRA1 e BCRA2. Este achado sugere diferentes maneiras que o câncer de mama se desenvolve e fornece pistas que promovem uma maior compreensão da causa do câncer de mama.7

1 Spagnolo SD, Ellis DW, Juneja S, Leong AS, et al. The role of molecular studies in lymphoma diagnosis: a review. Pathology 2004; 36 (1)19-44.

2 Spurbeck JL, Adams SA, Stupca PJ, Dewald GW. Primer on Medical Genomics Part XI: Visualizing Human Chromosomes. Mayo Clinic Proceedings 2004: 79: 58-75.Paik S, Hazan R, Fisher ER, et al. Resultados patológicos do projecto nacional cirúrgico adjuvante da mama e intestino: significado prognóstico da sobre-expressão da proteína erb B-2 no cancro da mama primário. J Clin Oncol 1990; 8: 103-112.

4 Tefferi a, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer on Medical Genomics Part II: Background Principles and Methods in Molecular Genetics. Mayo Clinic Proceedings 2002; 77: 785-808.

5 Tefferi a, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer on Medical Genomics Part II: Background Principles and Methods in Molecular Genetics. Mayo Clinic Proceedings 2002; 77: 785-808.

6 Paik S, Shak s, Tang G, et al. Ensaio Multi-gene PT-PCR para previsão da recorrência em doentes com carcinoma da mama negativo no nó—estudos B-20 e B-14 com NSABP. Proc do 26º Simpósio Anual sobre o cancro da mama em San Antonio. December 3-8k, 2003; San Antonio, TX, Abstract # 16.

7 Tefferi a, Bolander ME, Ansell SM, et al. Primer on Medical Genomics Part III: Microarray Experiments and Data Analysis. Mayo Clinic Proceedings2002; 77: 927-940.