10.4.2 Trehalose for criopreservation of mammalian cells
Cryopreservation has been commonly employed for the preservation of cells over extended periods at extremely low temperatures. No entanto, as alterações físicas que ocorrem durante a congelação e descongelação podem ser prejudiciais para a sobrevivência e as funções celulares. Assim, os crioprotetores têm que ser adicionados às células durante a criopreservação. O uso da trealose como crioprotetor para as células surgiu da noção de que os compostos poli-hidroxi são necessários em ambos os lados da membrana celular para que as células sejam preservadas por períodos mais longos . A trealose tem sido explorada por vários grupos como protetora para a criopreservação de várias células humanas.
Beattie et al. introduziu a trealose juntamente com DMSO nas células de Langerhans pancreáticas usando transição de fase líquida termotrópica . A criopreservação com trealose resultou em 92% de recuperação de Ilhéus adultos, em comparação com apenas 58% de recuperação usando apenas DMSO. 14 vezes mais insulina foi encontrada nos enxertos de Ilhéus criopreservados com trealose do que aqueles sem trealose. A recuperação de aglomerados celulares de ilhéu fetal humano (ICCs) criopreservados com trealose foi de 94%, em comparação com apenas 42% para aqueles sem trealose. Quando transplantado em ratinhos nus, observou-se um aumento de 15 vezes no conteúdo de insulina dos enxertos criopreservados com trealose. Estes resultados indicam que a adição de trealose como criopreservante leva a taxas de sobrevivência muito elevadas do tecido endócrino pancreático humano.
Toner e colegas de trabalho introduziram baixas concentrações de trealose nas células de mamíferos usando uma versão geneticamente modificada da proteína formadora de poros Alfa-hemolisina, e descobriram que a trealose intracelular pode melhorar muito a sobrevivência destas células durante a criopreservação . As taxas de sobrevivência pós-degelo a longo prazo dos fibroblastos criopreservados do rato e dos queratinócitos humanos foram, respectivamente, de 80% e 70%, numa concentração intracelular de trealose de 0, 2 M. Verificou-se também que a trealose intracelular tem um efeito benéfico na integridade da membrana das células de mamíferos secos, com uma recuperação de mais de 90% da membrana plasmática intacta observada após a secagem e armazenamento das células em condições ligeiras durante várias semanas .
o efeito da trealose na criopreservação de hepatócitos humanos foi investigado por Katenz et al. . As células hepáticas congeladas em meio de cultura com 10% de DMSO e 0,2 M de trealose apresentaram uma melhoria significativa na viabilidade celular pós-degelo e na eficiência de revestimento em comparação com o DMSO isoladamente. A presença de trealose durante a criopreservação também resultou no aumento do nível total de proteínas nas células associadas, níveis mais elevados de secreção de albumina e níveis mais baixos de aspartato aminotransferase após descongelação.
as células estaminais são ferramentas importantes para a investigação da hematopoiese, desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, bem como modelos de sistemas para certas doenças. Apesar da evolução da criopreservação, a morte pós-degelo continua a ser uma questão importante. Martinetti et al. usou trealose para criopreservar células estaminais hematopoiéticas puras e células progenitoras do sangue periférico, a fim de evitar a perda de células que ocorre durante o curso normal de criopreservação . A expressão do marcador de tronco da superfície CD34 foi avaliada e verificou-se que uma trealose de 1 M proporcionava uma melhor crioprotecção às células CD34+ com maior número de células e viabilidade celular quando comparada com o método padrão de congelação utilizando DMSO. Além disso, a criopreservação com trealose por períodos mais curtos e longos reteve a capacidade das células CD34+ para diferenciar em células megacariopoiéticas após descongelamento. Estes resultados sugerem a capacidade da trealose para manter a viabilidade e as funções das células-tronco quando usado como crioprotetor.
armazenamento a longo prazo de glóbulos vermelhos e plaquetas, mantendo um elevado grau de viabilidade, tem implicações importantes na transfusão sanguínea e na medicina clínica. Satpathy et al. descreveu um método para a carga de RBC com trealose a partir de um meio extracelular utilizando desequilíbrio osmótico e transição de fase fosfolípida que resultou em concentrações intracelulares de trealose de 40 mM . Verificou-se que a trealose exercia uma protecção osmótica das RBC por períodos mais longos. A secagem congelada dos mecanismos de argolas carregados com trealose, seguida de rehidratação, resultou em 55% de sobrevivência, com retenção da sua morfologia. As células sobreviventes sintetizaram ATP e 2,3-difosfoglicerato (DPG) e tinham baixos níveis de metemoglobina. A atividade de SOD e catalase e a estrutura secundária da hemoglobina nas RBC liofilizadas eram todas muito semelhantes às das RBC frescas. Este estudo demonstrou que a carga de trealose era necessária para a estabilização da hemoglobina e forneceu um passo importante para a criopreservação de RBC.
o tempo normal de armazenamento das plaquetas sanguíneas humanas nos bancos de sangue é de 5 dias após os quais são descartadas, resultando numa escassez crónica de plaquetas necessária para transfusão. Como um esforço para criopreservação de plaquetas por períodos mais longos, Wolkers et al. descreveu um método para introduzir trealose no citoplasma das plaquetas sanguíneas humanas . Verificou-se que a trealose era prontamente tomada pelas plaquetas humanas a 37°C, com uma eficiência de carga superior a 50%. A congelação da secagem e rehidratação das plaquetas carregadas com trealose resultou numa excelente recuperação de plaquetas intactas com uma taxa de sobrevivência de 85%. Estas plaquetas responderam de forma quase idêntica às plaquetas frescas para agonistas como trombina, ADP, colagénio e ristocetina. As microdominas de membrana e os componentes proteicos das plaquetas carregadas com trealose foram mantidos intactos após secagem e reidratação congeladas.O efeito protector da trealose foi também demonstrado nas células epiteliais da córnea dessecadas. A pré -incubação das células epiteliais da córnea cultivadas com trealose seguida de secagem resultou numa redução significativa da percentagem de células mortas, quando comparada com o meio de controlo . O efeito protector foi também confirmado ex vivo nos olhos enucleados de suínos, onde o tecido incubado com trealose era visivelmente mais suave . Estes resultados indicam a utilidade da trealose na oftalmologia e sua potencial aplicação como uma gota ocular para a síndrome do olho seco.
o uso de trealose para criopreservação de organelas foi demonstrado por Yamaguchi et al., que usou trealose como crioprotetor para mitocôndria congelada . As mitocôndrias congeladas na presença de trealose exibiram integridade mitocondrial e capacidade de resposta às proteínas da família Bcl-2 semelhantes às das mitocôndrias frescas. A ultra-estrutura, síntese de ATP, potencial transmembranar, inchaço induzido pelo cálcio, e a importação e processamento de proteínas precursoras também foram preservadas na presença de trealose. Isto é diferente do tampão padrão sacarose-manitol usado para congelar mitocôndrias que muitas vezes se torna Vazante. Assim, a trealose foi capaz de reter a maioria das características biológicas das mitocôndrias e mitocôndrias congeladas em trealose pode ser usada para pesquisa sobre apoptose e outras funções mitocondriais que dependem da integridade da mãe.
a trealose tem sido utilizada para a preservação de órgãos durante longos períodos. Uma” solução ET-Kyoto ” foi desenvolvida pelo Grupo de Wada para a preservação do pulmão de caninos por >30 horas sem afetar o desempenho das células endoteliais e vasculatura . A estabilização e preservação prolongadas de vacinas e anticorpos também foram conseguidas através da trealose.
