EuroMAbNet: Evropská Monoklonální Protilátky Sítě

Protokoly

Produkce Hybridomu

hybridomových je buněčné linie vzniklé z jedné hybridní buňka, která je schopna vylučovat monoklonální protilátky, specifické pro jeden epitop na antigen trvale v kultuře. Hybridní buňka je produkována fúzí specifické protilátky produkující B-buňky z imunizovaného zvířete (obvykle myši, krysy nebo králíka) a která má omezenou životnost, s buňkou z „nesmrtelné“ Kultivované buněčné linie myelomu (např.

Výroba myš hybridní buňka

Během proces fúze, B buňky jsou izolovány z myší sleziny, smíšené s myší myelomové buněčné linii a fusion je vyvolána s polyethylenglykol (PEG, viz Dodatek I). (Příslušná linie myelomu se používá při použití B buněk z jiných živočišných druhů). Výsledný hybridomas jsou pak kultivovány v tkáňové kultivační médium obsahující Hypoxathine, Aminopterin, Thymidinu (HAT), což je krok, který zabije všechny unfused myelomové buňky, které by mohly přerůst ostatní slabší buňky hybridomu. Nepoužité B buňky mají omezené pravomoci dělení a v kultuře přirozeně odumírají. Deset dní po procesu fúze se supernatant kultury shromáždí a testuje se na přítomnost požadované protilátky.

Schematické znázornění buněčné fúze

potřebné Vybavení

• sterilní prostředí, v němž se připravit a zvládnout buněk (laminární proudění nebo II. třídy kabinet)
• inkubátor nastavte na 37 ° C s 5% CO2 a vlhkosti 95%
• invertovaný mikroskop
• 37 ° C vodní lázeň, která může být umístěna v kabinetu
• odstředivky s swing-out rotor
• Sterilní pitevní nástroje -v ideálním případě dvě sady – každý se skládá ze dvou párů nůžky a kleště (jeden zakřivené a jeden tupý skončil).
• 75 ml tkáně Corning kultivační baňky-Ref. 15430641
• 24 jamkové Falcon desky – Ref. 353047
• Sterilní pipety
• Pipety výplň
• Sterilní pasteurovy pipety
• časovač

Střední a jiných činidel (Viz Dodatek A, pro více informací)

• RPMI 1640 bikarbonátový pufrovaný, s L-Glutaminem (Lonza Ref. BE12-702F)
• RPMI 1640 Hepes pufrovaný, bez L-Glutaminu
• kvalitní (dávky testované) Fetální Bovinní Sérum (Genycell Ref. GCS0101-500)
• penicilin/Streptomycin (Gibco Ref. 15070-063)
• Ultroser G (Pall Ref. 15950-017)
• HAT (Hypoxathin, Aminopterin, thymidin) (Gibco Ref. 21060-017)
• PEG 1500 (Roche Ref. 10783641001)

předtím, Než začnete (viz Dodatek A, pro více informací)

• Aby 500ml
• Aby 500ml střední+
• Se 100 ml média B
• Aby 100ml střední C
• Aby 500ml střední D

Rozmrazování a růst myelomových buněk

Rozmrazit myelomové buněčné linii a růst v médiu. K rozmrazení a kultivaci buněčné linie myelomu použijte následující metodu.

• vyjměte zmrazenou injekční lahvičku s myelomovými buňkami z úložiště LN2.
• umístěte buňky do vodní lázně o teplotě 37 ° C.
• uchovávejte víko mrazicí lahvičky nad hladinou vody, aby se snížila pravděpodobnost kontaminace.
• když jsou buňky téměř rozmrazeny (zbývá jen malý kus ledu), přesuňte se do kapuce tkáňové kultury.
• otřete vnější stranu injekční lahvičky 70% ethanolem a odstraňte horní část.
• opatrně odstraňte buněčnou suspenzi sterilní pasteurovou pipetou.
• Přeneste obsah do centrifugační zkumavky obsahující 10 ml média (viz dodatek A)
• Spin buněčné suspenze jemně v 300 g po dobu 5 min.
• Odstraňte supernatant a resuspendujte buňky v 10 ml čerstvého média a místo v malé (25cm2) baňky.
• Vezměte 1 ml suspenze z původní baňky a přidejte do druhé s 9mls střední a. To zajišťuje, že pokud koncentrace v první baňce je příliš vysoká, druhá (nižší) koncentrace buněk je k dispozici.
• vložte baňky do inkubátoru CO2. Nezapomeňte nechat víčka baňky mírně otevřená, aby se umožnila výměna plynů.

proces fúze

Tři dny před – Připravit myelomové buňky pro fusion

myelomové buňky musí být v exponenciální růstové fázi, když je budete používat, a to je zážitek. Pokud však nastavíte dvě 75 cm2 baňky svých myelomových buněk, jednu v ředění 1: 40 a jednu v 1: 60 (viz níže), 3 dny před fúzí by měla být jedna z baněk ideální v den fúze. (Původně zřizování dalších baněk na ředění nad a pod ty zde uvedené by měly poskytnout vám zkušenosti, které jsou nezbytné posoudit tempo růstu myelomových buněk pro následné fúze).

Jeden den před – připravit střední

následující musí být provedeny a pre-zahřeje na 37 ° C (můžete dát je do inkubátoru přes noc).

• Dvě x 200 ml medium+ ve dvou 75cm2 baněk
• 100 ml medium B
• 100ml střední C
• 1x4ml PEG 1500 převedeny do fólie zabalené (PEG je citlivé na světlo) sterilní univerzální
• mini vodní lázeň, vyroben z 200 ml kádinky obsahující asi 100 ml destilované vody a přešel s páskou dostatečně široká tak, že tam je otvor, držet 50ml Falcon zkumavky ve svislé poloze

Den fúze

• Zabít myš (po institucionální směry), extrakt sleziny a vložte jej do sterilní nádoby, která obsahuje 5 ml střední C.
• všechny následující kroky musí být provedeny v odsavači laminárního proudění.

• vložte slezinu a médium do Petriho misky.
• přesuňte slezinu sterilními kleštěmi, abyste ji umyli. Odstraňte všechny adheze a přeneste slezinu do druhé Petriho misky
• . Držet jednu polovinu s tupou pinzetou a pomocí další dvojice zakřivené kleště, jemně dráždit buňky ze sleziny kapsle, dávejte pozor, aby odstranit co nejvíce buněk. Opakujte použití druhé poloviny sleziny
• odstraňte zbytky sleziny a pomocí sterilní Pasteurovy pipety dobře promíchejte buňky, ale velmi jemně.
• přeneste buněčnou suspenzi do 15ml zkumavky a použijte dalších 5 ml média C k opláchnutí Petriho misky a přidání do buněk sleziny ve zkumavce.
• počítejte myelom a buňky sleziny.
• potřebujete poměr 1 myelomové buňky na každých 10 buněk sleziny
• přidejte myelomové buňky do 50ml kuželové zkumavky.
• Odstředěte jak buňky sleziny (15 ml zkumavka), tak buňky myelomu v (50 ml zkumavka) na 300 g po dobu 10 minut.
• Velmi opatrně slijeme supernatant obou trubek a opatrně resuspendovat pelet v každé 10mls střední B. V nepřítomnosti FBS, dokud proces fúze je dokončena, je velmi důležité, protože buňky se nemohou pojistku, pokud tam je FBS dárek)

• Kombinovat resuspendovaných buněk sleziny a myelom pelety do jedné 50ml centrifugační kyvety.
• odstřeďujte 5 minut při 300g.
• velmi opatrně vylijte co nejvíce supernatantu.
• znovu promícháme peletu jemným poklepáním na trubici na lavici. Ne flick pelety nebo pipety jako že se to bude distribuovat buněk kolem trubice, snížení počtu buněk, které jsou k dispozici pro fusing.
• vložte zkumavku do domácí vodní lázně.
• přidejte 1,2 ml PEG po kapkách po dobu jedné minuty za mírného míchání každých několik kapek.
• přidejte 1 ml média B, po kapkách po dobu jedné minuty a jemně promíchejte každých několik kapek.
• Přidejte další 2 ml média B, po kapkách během dvou minut, za stálého míchání jemně každých pár kapek.
• Přidat další 4 ml média B, po kapkách v průběhu čtyř minut, jemně míchání každých pár kapek.
• Na konci, přidejte 8 ml střední C.
• Centrifugační zkumavky buněk za 5 minut 300g.
• Velmi opatrně slijte supernatant a resuspendujte buněčné pelety po dobu 1 minuty s 10 ml média+. Chcete-li to provést, přidejte několik ml média, abyste začali rozbít peletu. Tyto shluky buněk velmi jemně vysajte a v pipetě se pohybujte nahoru a dolů. Vyhoďte tyto buňky a opakujte proces. Buďte velmi jemní, netlačte peletku od sebe, po dokončení můžete mít malé shluky buněk. Buňky jsou v této fázi extrémně křehké.
• 10mls resuspendované fusion mix do 190ml teplé medium+
• konečný objem je 200ml
• Dejte 1 ml této suspenze do každé jamky 8 x 24 (2 ml) desky. (Celkem 192 jamek)
• nechte destičky v inkubátoru přes noc (zhruba 24 hodin).

den po fúzi

• přidejte 8 ml klobouku do 200 ml média a+.
• vložte 1 ml tohoto selektivního média do každé jamky z 8 destiček.
• nechte destičky v inkubátoru. Kolonie se objeví mezi 7 až 10 dní

Příloha I

Kultivační Médium:
RPMI 1640 médium s L-Glutaminem (bikarbonátový pufrovaný) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ penicilin (100U / ml) / Streptomycin (100 mg / l) (Gibco Ref. 15070-063)

Kultivační Médium A+:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)

Culture Medium B (no FBS):
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium C:
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium D:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)
+ HAT (Hypoxathine, Aminopterin, Thymidine) supplement which is usually 50X (dilute 10ml in 500mls of medium) (Gibco Ref. 21060-017)