Multi-color barvení s fluorescenční barviva, je aktivně používá pro pozorování distribuce biologických materiálů (jako jsou proteiny, lipidy, nukleové kyseliny, a ionty) v oblasti tkání a buněk a výzkum. Detekční technologie pro fluorescenční pozorování pokročila na úroveň, při které lze za nejlepších okolností detekovat jednu molekulu fluorescenčního barviva. Tato část popisuje několik důležitých aspektů fluorescenční celoživotní zobrazovací mikroskopie (FLIM), nové technologie fluorescenční mikroskopie. Kromě vícebarevného barvení lze fluorescenční celoživotní zobrazování také využít k vizualizaci faktorů, které ovlivňují vlastnosti fluorescenční životnosti molekuly barviva,tj.
Vlnová Spektroskopie
Konvenční fluorescenční mikroskopie využívá vlastnosti barev fluorescenčního barviva, to znamená, že identifikace je založena na rozdílech ve fluorescenční spektrální charakteristiky mezi barviva. S touto technikou lze pět nebo šest barviv v rozsahu vlnových délek od ultrafialového až po blízké infračervené záření použít současně pod mikroskopií bez záměny barev.
celoživotní spektroskopie
každé fluorescenční barvivo má svou vlastní životnost ve excitovaném stavu. Detekcí rozdílů v životnosti je možné rozlišit i barviva, která mají stejnou fluorescenční barvu, a také identifikovat autofluorescenci. Kromě toho, high signál-šum snímků lze získat pomocí sondy s velmi dlouhou životností ve srovnání s fluorescenční barviva běžně používá. Například, platinum coproporphyrin má životnost milisekundu, aby, zatímco životnost běžných fluorescenční barviva jsou nanosekund pořadí. Taková relativně dlouhověká fluorescenční barviva budou brzy použita jako sondy pro detekci DNA na čipech.
fluorescenční celoživotní zobrazování také umožňuje získat informace o molekulách při pozorování živé buňky. Faktory ovlivňující fluorescence lifetime patří ion intenzita, hydrofobní vlastnosti, koncentrace kyslíku, molekulární vazba a molekulární interakce tím, že přenos energie když se dva proteiny k sobě přibližují. Životnost je však nezávislá na koncentraci barviva, fotobleachingu, rozptylu světla a intenzitě budicího světla. Proto nám fluorescenční celoživotní zobrazování umožňuje provádět přesné měření koncentrace iontů a analýzu přenosu energie fluorescenční rezonance (FRET).
existují dvě metody zobrazování života fluorescence: metoda časové domény a metoda frekvenční domény.
- FLIM v časové oblasti-v některých případech zpoždění po excitaci pulzním laserem lze fluorescenční obraz získat hradlovým provozem zesilovače obrazu. Životnost se měří v nanosekundách laserem s dobou trvání pulsu několika set picoseconds a nanosekundy-úroveň spouště, protože životnost buzení stavu je obvykle 1 až 20 nanosekund. Vysokorychlostní zesilovač obrazu brány je komerčně dostupný od společnosti Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japonsko). Životnost fluorescence v každém pixelu lze také získat měřením při změně doby zpoždění, dokud se brána neotevře. Fluorescenční celoživotní obrazy jsou zobrazeny v pseudocolor podle jejich životnosti.
- Frekvenční domény FLIM – Fluorescence lifetime je vypočítána na základě měření fázového posunu fluorescence a snížení jeho amplitudy pomocí detektoru se ziskem modulátor, když je laser používán jako budící zdroj světla je modulace (1 až 200 mhz). Měření lze provádět buď laserovým skenováním (fotonásobičem) nebo pomocí zařízení s nábojem (CCD).
Aplikace
životní prostředí v okolí sondy je zjištěna na základě skutečnosti, že fluorescence lifetime je citlivý na koncentrace vodíkových iontů (pH), kyslík, a vápenatých iontů koncentrace. Vazba nebo interakce mezi molekulami lze také měřit v kombinaci s pražcem.
Koncentrace Iontů Vápníku Imaging
Když vápenatých iontů váže fluorescenční sondy jako je Fura-2, Fluo-3, nebo Vápníku Zelená, fluorescenční životnost a intenzita fluorescence změnit. Konvenční postup pro měření koncentrace iontů se zaměřuje na změnu intenzity. Podle změny koncentrace vápenatých iontů, poměr barev mezi vázaného i nevázaného vápníku iontové změny, a to následně vede ke změně fluorescence lifetime měřicí místo ve vzorku. Kromě iontové sondy vápníku je tato technika použitelná také pro měření pH a dalších iontů,jako je iont sodíku a iont hořčíku.
fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET)
výzkum je v současné době prováděn na pražci variantami zeleného fluorescenčního proteinu (GFP s jinou fluorescenční barvou). FRET umožňuje měřit interakce (asociaci nebo disociaci) mezi dvěma proteiny, které jsou označeny dvojicí fluorescenčních barviv. Dárce fluorescenční barvivo má kratší excitační/emisní vlnové délky, které poskytují energii na akceptor fluorescence barviva. Životnost excitačního stavu dárcovského barviva je proměnlivá v závislosti na tom, zda akceptor (barvivo přijímající energii) existuje nebo ne. Měření založené na životnosti umožňuje lepší kvantifikaci, protože při detekci není nutné zvažovat překrývání fluorescence.
klinické zobrazování
protože některé tkáňové a cytodiagnostické vzorky mají silnou autofluorescenci, pokusilo se o použití sond s dlouhou životností (až milisekundy). Sondy s dlouhou životností jsou také užitečné při fluorescenční hybridizaci in situ (FISH), protože počet barev, které lze použít současně, je u této techniky omezen. Koncentrace vodíkových iontů v krvi, stejně jako tlak kyslíku a oxidu uhličitého, již byly měřeny na základě životnosti fluorescence, i když taková měření stále nejsou možná pod mikroskopií.
internetové zdroje
- Centrum pro fluorescenční spektroskopii-moderuje profesor Joseph R. Lakowicz na University of Maryland, tento web je vynikající zdroj pro informace o fluorescence lifetime imaging a další aspekty fluorescenční spektroskopie a mikroskopie.
- Kentech Instruments-Kentech vyrábí vysokonapěťové polovodičové pulzní generátory a optické gated zobrazovací systémy pro fluorescenční celoživotní zobrazování.
- Hamamatsu Photonics – kromě své vynikající řady digitálních kamerových systémů vyrábí Hamamatsu také fotonásobiče, lavinové fotodiody a vysokorychlostní zesilovače obrazu brány.
- PRS BioSciences-prs BioSciences se specializuje na biologickou fluorescenční mikroskopii a vyrábí systém s náhradními díly, který lze přizpůsobit mnoha výzkumným mikroskopům.
