Giemsa Stain: Princip, Postup a Výsledky

Giemsa stain je typu Romanowsky skvrna, pojmenované po Gustavu Giemsa, německý chemik, který vytvořil roztoku barviva. Byl primárně určen pro demonstraci malarických parazitů v krevních nátěrech, ale je také používán v histologii pro rutinní vyšetření krevního nátěru.

Použití Giemsa Stain

na Rozdíl od barvení malarických parazitů, Giemsa stain má řadu aplikací v Mikrobiologii a Patologii:

• Giemsa stain se používá k získání diferenciálního počtu bílých krvinek.
• používá se také k diferenciaci nukleární a cytoplazmatické morfologie různých krevních buněk, jako jsou krevní destičky, RBC, WBC.
• V Mikrobiologii, Giemsa stain se používá pro barvení zařazení subjektů v Chlamydia trachomatis, Borrelia druhů, a pokud Wayson je skvrna není k dispozici, skvrny Yersinia pestis. Giemsa stain se také používá k barvení Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci, Klebsiella granulomatis, Penicillium marneffei a příležitostně bakteriálních tobolek.
• tato skvrna se také používá v cytogenetice k barvení chromozomů a identifikaci chromozomálních aberací. To je běžně používané pro G-pruhování (Giemsa-Pruhy)

Princip Giemsa Stain

Giemsa stain je diferenciální skvrny a obsahuje směs Azurové, Methylenová modř, Eosin barvení. Je specifický pro fosfátové skupiny DNA a váže se tam, kde je velké množství adenin-thyminové vazby.

Azur a eosin jsou kyselé barvivo, které variabilně barví základní složky buněk, jako jsou cytoplazma, granule atd.

methylenová modř působí jako základní barvivo, které barví kyselé složky, zejména jádro buňky.

Methanol působí jako fixační prostředek stejně jako buněčná skvrna. Fixativa neumožňuje žádné další změny v buňkách a činí je dodržovat sklíčko.

složení Giemsa Stain

Giemsa stain může být připraveno v domě za použití Giemsa stain powder nebo může být komerčně získáno. Základní složky obou jsou stejné; ředění však lze provádět v závislosti na použití.

POSTUP

a. Pro In-house příprava skvrna:

1. Naváží požadované množství prášku skvrnu, a přeneste do čisté, suché 1litre kapacita lahví. Přidejte methanol a dobře promíchejte.
2. změřte a přidejte glycerol a dobře promíchejte.
3. umístěte lahvičku skvrny do vodní lázně při 50-60°C nebo při 37°C po dobu až 2 hodin s častým mícháním.
4. lahvičku označte a uchovávejte na chladném a tmavém místě s pevnou zátkou.

POZNÁMKA: Pokud se voda dostane do kontaktu během jakékoliv kroky přípravy skvrna, skvrna dostane rozmazlená, proto použití, suché sklo a obchod v podmínkách, kde by bez kontaktu s vodou.

• Filtr skvrnu pomocí Whatman filterpaper ne.1 a zředí se vodou pufrované na pH 7.2, aby se pracovní roztoky

B. Pro barvení diapozitivů

se metoda barvení, koncentrace a načasování použitých skvrn liší podle účelu, například tenké krevní nátěry používají ředění zásob 1: 20, zatímco pro hustý krevní nátěr se používá ředění 1:50.

ForThin krevní nátěr

1. Opravit vysušené film v absolutním methanolu ponořením film krátce (dva poklesy) v nádobě Coplin obsahující absolutní methanol.
2. vyjměte a nechte uschnout na vzduchu.
3. skvrna zředěnou skvrnou Giemsa (1: 20, vol / vol) po dobu 20 minut (pro 1:20 ředění, přidejte 2 ml zásobní Giemsy do 40 ml pufrované vody v koplinové nádobě).
4. omyjte krátkým ponořením sklíčka dovnitř a ven z koplinové nádoby s pufrovanou vodou (jeden nebo dva poklesy).
   Poznámka: nadměrné praní odbarví film.
5. nechte uschnout na vzduchu ve svislé poloze. Pozorujte pod mikroskopem nejprve při 40X a poté pomocí čočky pro ponoření do oleje

pro tlusté krevní nátěry

1. nechte film několik hodin nebo přes noc důkladně vyschnout na vzduchu. Nevysušujte filmy v inkubátoru nebo teplem, protože to fixuje krev a narušuje lýzu RBC.
   Poznámka: Pokud je nutná rychlá diagnóza malárie, mohou být tlusté filmy mírně tenčí než obvykle, ponechány 1 hodinu zaschnout a poté obarveny.
2. NEOPRAVOVAT.
3. Skvrnu zředěným Giemsa stain (1:50, obj./obj.), 50 min (Pro 1:50 ředění, přidejte 1 ml zásobního Giemsa 50 ml pufrované vody v nádobě Coplin)
4. Mytí uvedení filmu v pufrované vody pro 3 až 5 min.
5. Nechte uschnout ve svislé poloze a pozorovat pod mikroskopem nejprve na 40X a pak pomocí olejového imerzního objektivu

Pro Chlamydia trachomatis

Postupujte podle výše uvedených kroků, ale s zřeďte skvrnu 1:40 ředění (přidat 0,5 ml zásobního roztok Giemsa na 19,5 ml pufrované vody) a nechte skvrnu po dobu 90-120 minut.

pozorování:

při mikroskopickém pozorování se buněčné organely, bakterie a paraziti rozlišují na základě jejich morfologie a barvy;