10.4.2 Trehalosa pro kryoprezervaci savčích buněk
Kryokonzervace byl běžně používané pro konzervaci buněk po delší dobu v extrémně nízkých teplotách. Fyzické změny, ke kterým dochází během zmrazování a rozmrazování, však mohou být škodlivé pro přežití a funkce buněk. Proto musí být kryoprotektanty přidávány do buněk během kryokonzervace. Použití trehalosa jako ochranném pro buňky vynořil z představy, že polyhydroxy sloučeniny jsou povinné na obou stranách buněčné membrány pro buňky, které mají být zachovány po delší dobu . Trehalóza byla zkoumána několika skupinami jako ochranný prostředek pro kryokonzervaci různých lidských buněk.
Beattie et al. zavedena trehalóza spolu s DMSO do pankreatických Langerhansových buněk pomocí termotropního přechodu kapalné fáze . Kryokonzervace trehalózou vedla k 92% zotavení dospělých ostrůvků ve srovnání s pouze 58% zotavení při použití samotného DMSO. U štěpů z ostrůvků kryokonzervovaných trehalózou bylo nalezeno čtrnáctkrát více inzulínu než u štěpů bez trehalózy. Oživení lidského plodu ostrůvek-jako shluky buněk (ICCs) kryokonzervované s trehalosa byla 94%, oproti pouze 42% pro ty, bez trehalosa. Při transplantaci u nahých myší bylo pozorováno 15násobné zvýšení obsahu inzulínu štěpů z ICC kryokonzervované trehalózou. Tyto výsledky naznačují, že přidání trehalózy jako kryokonzervant vede k velmi vysoké míře přežití lidské pankreatické endokrinní tkáně.
Toner a spolupracovníky představil nízké koncentrace trehalosy do savčích buněk pomocí geneticky upravené verze pórů tvořících protein alfa-hemolyzinový, a zjistil, že intracelulární trehalosy může výrazně zlepšit přežití těchto buněk v průběhu kryokonzervace . Dlouhodobé post-tání přežití kryokonzervované myši fibroblastů a lidských keratinocytů byly 80% a 70%, v intracelulární trehalosy koncentrace 0,2 M. Intracelulární trehalosy bylo také zjištěno, že mají příznivý vliv na membránové integrity sušené savčích buněk, s více než 90% využití neporušené plazmatické membrány pozorovány při sušení a skladování buněk za mírných podmínek za několik týdnů .
účinek trehalózy na kryokonzervaci lidských hepatocytů byl zkoumán Katenz et al. . Jaterní buňky zmrazené v kultivačním médiu s 10% DMSO a 0,2 M trehalosa ukázala výrazné zlepšení v post-tání životaschopnost buněk a pokovování účinnost ve srovnání s DMSO sám. Přítomnosti trehalosy během kryokonzervace také za následek zvýšení celkové bílkoviny úrovni v přiložených buněk, vyšší vylučování albuminu v krvi a nižší aspartátaminotransferázy v krvi po rozmrazení.
kmenové buňky jsou důležitými nástroji pro vyšetřování krvetvorby, vývoj nových terapeutických strategií a modelových systémů pro určité nemoci. Navzdory vývoji v kryokonzervaci zůstává smrt buněk po rozmrazení hlavním problémem. Martinetti a kol. používá trehalosa, aby zmrazili čisté hematopoetických kmenových a progenitorových buněk z periferní krve za účelem zabránit buněk, ke které dochází při normálním průběhu kryokonzervace . Vyjádření povrchu stonku marker CD34 byl vyhodnocen a 1 M trehalosa bylo zjištěno, že poskytují lepší cryoprotection na CD34+ buňky s vyšší cele číslo a životaschopnosti buněk oproti standardní metoda zmrazování pomocí DMSO. Navíc kryokonzervace trehalózou po kratší a delší dobu si zachovala schopnost buněk CD34+ diferencovat se na megakaryopoetické buňky po rozmrazení. Tyto výsledky naznačují schopnost trehalózy udržet životaschopnost a funkce kmenových buněk při použití jako kryoprotektant.
dlouhodobé uchovávání červených krvinek (RBC) a krevních destiček při zachování vysokého stupně životaschopnosti má významné důsledky v krevní transfuzi a klinické medicíně. Satpathy et al. popsal metodu pro načítání červených Krvinek s trehalosa z extracelulárního média pomocí osmotické nerovnováhy a fosfolipid fáze přechodu, která vyústila v intracelulární trehalosy koncentrace 40 mM . Bylo zjištěno, že trehalóza vykazuje osmotickou ochranu RBC po delší dobu. Zmrazit sušení trehalosa-vloženého Rbc následovala rehydratace vyústil v 55% přežití s zachování jejich morfologie. Přežívající buňky syntetizovaly ATP a 2,3-difosfoglycerát (DPG) a měly nízké hladiny methemoglobinu. Aktivita SOD a katalázy a sekundární struktura hemoglobinu v lyofilizovaných RBC byly všechny velmi podobné aktivitám čerstvých RBC. Tato studie prokázala, že pro stabilizaci hemoglobinu bylo nutné zatížení trehalózou a poskytlo důležitý krok směrem ke kryokonzervaci RBC.
normální doba skladování lidských krevních destiček v krevních bankách je 5 dní, po které jsou vyřazené, což má za následek chronický nedostatek krevních destiček potřebné pro transfuzi. Jako snaha o kryokonzervaci krevních destiček po delší dobu, Wolkers et al. popsaný způsob zavedení trehalózy do cytoplazmy lidských krevních destiček . Trehalosa bylo zjištěno, že snadno uptaken lidské krevní destičky při 37°C s ložnou účinnost více než 50%. Zmrazit sušení a rehydratační z trehalosa-naložený destiček za následek vynikající oživení neporušený krevní destičky s přežití 85%. Tyto krevní destičky reagovaly téměř stejným způsobem jako čerstvé krevní destičky vůči agonistům, jako je trombin, ADP, kolagen a ristocetin. Membránové mikrodomény a proteinové složky krevních destiček naložených trehalózou byly po lyofilizaci a rehydrataci udržovány neporušené.
ochranný účinek trehalózy byl také prokázán u dessikovaných epiteliálních buněk rohovky. Preinkubační kultivovaných epiteliálních buňkách rohovky s trehalosa následuje sušení za následek významné snížení podílu mrtvých buněk ve srovnání s kontrolou medium . Ochranný účinek byl také potvrzen ex vivo v enukleovaného prasat oči, kde tkáně inkubovány s trehalosa byla viditelně hladší . Tyto výsledky naznačují užitečnost trehalózy v oftalmologii a její potenciální aplikaci jako oční kapky pro syndrom suchého oka.
použití trehalózy pro kryokonzervaci organel bylo prokázáno Yamaguchi et al., který používal trehalózu jako kryoprotektant pro zmrazené mitochondrie . Mitochondrie zmrazené v přítomnosti trehalózy vykazovaly integritu mitochondriální vnější membrány (MOM) a citlivost na proteiny rodiny Bcl-2 podobné proteinům čerstvých mitochondrií. Na ultrastructure, ATP syntézy, transmembránový potenciál, vápníkem-indukované bobtnání, a import a zpracování prekurzorových proteinů byly také zachovány v přítomnosti trehalosy. To je na rozdíl od standardního pufru sacharózy a mannitolu používaného pro zmrazení mitochondrií, které se často stávají netěsnými. Tak trehalosy byl schopen udržet většinu biologických funkcí mitochondrií a trehalosa-zmrazené mitochondrie mohou být použity pro výzkum apoptózy a další mitochondriální funkce, které spoléhají na MÁMU integrity.
trehalóza se používá k uchování orgánů po delší dobu. Skupina Wada vyvinula „ET-Kjótské řešení“ pro uchování psích plic po dobu >30 hodin bez ovlivnění výkonu endotelových buněk a vaskulatury . Pomocí trehalózy bylo také dosaženo dlouhodobé stabilizace a konzervace vakcín a protilátek.
