Metody Čištění Proteinů: 4 Metody

Tento článek vrhá světlo na čtyři metody čištění proteinů.

čtyři metody čištění proteinů jsou: (1) Extrakce (2) Srážky a Diferenciální Vyluhování (3) Ultracentrifugation a (4)Chromatografické Metody.

metody používané při čištění proteinů lze zhruba rozdělit na analytické a preparativní metody.

rozlišení není přesné, ale rozhodujícím faktorem je množství proteinu, které lze touto metodou prakticky vyčistit. Analytické metody cílem detekovat a identifikovat protein ve směsi, vzhledem k tomu, preparativní metody mají za cíl produkovat velké množství bílkovin pro jiné účely, jako jsou strukturní biologie nebo průmyslové použití. Obecně lze preparativní metody použít v analytických aplikacích, ale ne naopak.

Metoda # 1. Extrakce:

v závislosti na zdroji musí být protein přiveden do roztoku rozbitím tkáně nebo buněk, které ji obsahují. Existuje několik způsobů, jak toho dosáhnout; opakované zmrazování a rozmrazování, sonikace, homogenizace vysokým tlakem nebo permeabilizace organickými rozpouštědly. Způsob výběru závisí na tom, jak křehký je protein a jak robustní jsou buňky.

po tomto extrakčním procesu bude rozpustný protein v rozpouštědle a může být oddělen od buněčných membrán, DNA atd. centrifugací. Extrakční proces také extrahuje proteázy, které začnou trávit proteiny v roztoku. Pokud je protein citlivý na proteolýzu, je obvykle žádoucí postupovat rychle a udržovat extrakt ochlazený, aby se zpomalila proteolýza.

Metoda # 2. Srážení a diferenciální solubilizace:

při hromadném čištění proteinů je běžným prvním krokem k izolaci proteinů srážení síranem amonným (NH4)2SO4. To se provádí přidáním rostoucího množství síranu amonného a sběrem různých frakcí precipitátového proteinu. Jednou z výhod této metody je, že může být provedena levně s velmi velkými objemy.

první proteiny, které mají být čištěny, jsou ve vodě rozpustné proteiny. Čištění integrálních membránových proteinů vyžaduje narušení buněčné membrány s cílem izolovat jeden konkrétní protein od ostatních, které jsou ve stejné membrány prostoru. Někdy konkrétní membránu trakce může být izolován první, jako izolace mitochondrií z buněk, než čištění protein se nachází v mitochondriální membráně.

čisticí prostředek, jako je dodecyl sulfát sodný (SDS) může být použit k rozpuštění buněčné membrány a udržet membránových proteinů v roztoku během čištění; nicméně, protože SDS způsobuje denaturaci, mírnější detergentů jako je Triton X-100 a CHAPS může být použit k udržení proteinu nativní konformaci během čištění.

Metoda # 3. Ultracentrifugace:

centrifugace je proces, který využívá odstředivou sílu k oddělení směsí částic o různých hmotnostech nebo hustotách suspendovaných v kapalině. Když plavidlo (typicky zkumavky nebo lahve) obsahující směs proteinů nebo jiných částic, jako jsou bakteriální buňky, se otáčí vysokou rychlostí, moment hybnosti výnosy vnější síly na každou částici, která je úměrná jeho hmotnosti.

tendence dané částice pohybovat se kapalinou kvůli této síle je kompenzována odporem, který kapalina působí na částici. Čistý efekt „točí“ vzorku v centrifugační je to masivní, malé a husté částice se pohybují směrem ven rychleji než méně hmotné částice nebo částice s více „táhnout“ v kapalině.

Když se suspenzí částic se „točil“ v centrifuze, „pelety“ může tvořit na dně nádoby, který je obohacen o nejhmotnější částice s nízký odpor v kapalině. Zbývající, non-zhutněný částice stále zůstává převážně v kapalině se nazývá „supernatant“ a mohou být odstraněny z nádoby oddělit supernatant od peletu.

rychlost odstřeďování je podle úhlové zrychlení působící na vzorek, obvykle měří v porovnání s g. Pokud jsou vzorky odstředěny dost dlouho, částice v nádobě dosáhne rovnováhy, přičemž částice se hromadí konkrétně na bod v nádobě, kde jejich nafukovací hustota je v rovnováze s odstředivou silou. Taková“ rovnovážná “ centrifugace může umožnit rozsáhlé čištění dané částice.

sacharosa gradient centrifugace:

lineární koncentrační gradient cukru (obvykle sacharóza glycerol, nebo Percoll) je generován ve zkumavce tak, že nejvyšší koncentrace je na dně a nejnižší na vrcholu. Vzorek proteinu je pak vrstven na horní část gradientu a spřádán vysokou rychlostí v ultracentrifuge. To způsobuje, že těžké makromolekuly migrují směrem ke dnu zkumavky rychleji než lehčí materiál.

během odstředění v nepřítomnosti sacharózy, jak se částice pohybují dále a dále od středu otáčení, zažívají stále více odstředivé síly (čím dále se pohybují, tím rychleji se pohybují). Problém je v tom, že užitečný rozsah oddělení uvnitř nádoby je omezen na malé pozorovatelné okno.

točení vzorku dvakrát tak dlouho neznamená, že částice zájmu půjde dvakrát tak daleko; ve skutečnosti to půjde výrazně dále. Když se však proteiny pohybují gradientem sacharózy, setkávají se s kapalinou zvyšující se hustoty a viskozity.

správně navržený gradient sacharózy bude působit proti rostoucí odstředivé síle, takže částice se pohybují v těsném poměru k době, kdy byly v odstředivém poli. Vzorky oddělené těmito gradienty se označují jako centrifugace“ zonální rychlosti“. Po oddělení proteinu/částic se gradient pak frakcionuje a shromažďuje.

Metoda # 4. Chromatografické metody:

protokol čištění proteinů obvykle obsahuje jeden nebo více chromatografických kroků. Základním postupem v chromatografii je proudit roztok obsahující protein kolonou naplněnou různými materiály. Různé proteiny interagují jinak s sloupce materiálu, a může tak být oddělen od času musí projít kolonou, nebo podmínky, které musí eluovat proteinu z kolony. Obvykle jsou proteiny detekovány, když vystupují z kolony svou absorpcí při 280 nm.

existuje mnoho různých chromatografických metod:

1. Size Exclusion Chromatografie:

Chromatografie může být použita k oddělení bílkovin v roztoku nebo denaturace podmínky pomocí porézní gely. Tato technika je známá jako chromatografie s vyloučením velikosti. Princip spočívá v tom, že menší molekuly musí procházet větším objemem v porézní matrici. Proto, proteiny určitý rozsah ve velikosti, bude vyžadovat variabilní objem eluant (rozpouštědlo), než budou shromážděny na druhém konci sloupce gelu.

v souvislosti s purifikací proteinů se eluant obvykle sdružuje do různých zkumavek. Všechny zkumavky, které neobsahují měřitelnou stopu proteinu k čištění, se zlikvidují. Zbývající roztok je tedy vyroben z proteinu pro čištění a dalších podobně velkých proteinů.

2. Iontoměničová chromatografie:

iontoměničová chromatografie odděluje sloučeniny podle povahy a stupně jejich iontového náboje. Sloupec, který má být použit, je vybrán podle typu a síly náboje. Anionovými mají kladný náboj a jsou používány k udržení a oddělit záporně nabité com liber, zatímco katexová pryskyřice mají záporný náboj a jsou používány k samostatné kladně nabité molekuly.

Před separace začíná vyrovnávací paměti je čerpána přes sloupec dosáhl rovnováhy soupeře nabité ionty. Po injekci vzorku se molekuly rozpuštěné látky vymění s pufrovými ionty, protože každá soutěží o vazebná místa na pryskyřici. Délka retence pro každou rozpuštěnou látku závisí na síle jejího náboje.

nejslabší nabité sloučeniny se eluují jako první, následované sloučeninami s postupně silnějšími náboji. Vzhledem k povaze separačního mechanismu, pH, Typ pufru, koncentrace pufru a teplota hrají důležitou roli při řízení separace. Iontoměničové chromatografie je velmi mocný nástroj pro použití v čištění proteinů a je často používán jak v analytické a preparativní separace.

3. Afinitní Chromatografie:

Afinitní Chromatografie je separační technika založená na molekulární konformaci, která často využívá aplikačně specifických pryskyřic. Tyto pryskyřice mají ligandy připojené ke svým povrchům, které jsou specifické pro sloučeniny, které mají být odděleny. Nejčastěji tyto ligandy fungují podobným způsobem jako interakce protilátka-antigen. Tento „zámek a klíč“ zapadají mezi ligand a jeho cílovou sloučeninu, což z něj činí vysoce specifickou, často generující jediný vrchol, zatímco vše ostatní ve vzorku není zachováno.

mnoho membránových proteinů jsou glykoproteiny a mohou být čištěny lektinovou afinitní chromatografií. Detergentní solubilizované proteiny se mohou vázat na chromatografickou pryskyřici, která byla upravena tak, aby měla kovalentně připojený lektin.

Proteiny, které se nevážou k lektin jsou odplaveny a pak specificky vázané glykoproteiny mohou být eluován přidáním vysoké koncentrace cukru, která konkuruje vázané glykoproteiny na lektin vazebné místo. Některé lektiny vysokou afinitu vazby na oligosacharidy glykoproteinů, že je těžké soupeřit s cukry a vázané glykoproteiny muset být propuštěn denaturaci lektin.

4. Vazba kovů:

běžná technika zahrnuje inženýrství sekvence 6 až 8 histidinů do C-terminálu proteinu. Polyhistidin se silně váže na dvojmocné kovové ionty, jako je nikl a kobalt. Protein může procházet kolonou obsahující imobilizované ionty niklu, které váže polyhistidinovou značku. Všechny neoznačené proteiny procházejí kolonou.

protein může být eluovány s imidazolu, který soutěží s polyhistidine tag pro vazby na sloupci, nebo snížením pH (obvykle 4,5), což snižuje afinita značky pro pryskyřice. Zatímco tento postup se obvykle používá pro čištění rekombinantních proteinů s analýzou affinity tag (např. 6xHis-tag nebo Clontech KLOBOUK tag), to může být také použit pro přírodní proteiny s vlastní afinitu tor dvojmocné kationty.

5. Imunoafinitní Chromatografie:

Imunoafinitní chromatografie používá specifickou vazbu protilátky na cílový protein k selektivnímu čištění proteinu. Postup zahrnuje imobilizaci protilátky na sloupcový materiál,který pak selektivně váže protein, zatímco vše ostatní protéká. Protein se může IX eluovat změnou pH nebo slanosti. Protože tato metoda nezahrnuje inženýrství ve značce, může být použita pro proteiny z přírodních zdrojů.

6. HPLC:

vysokoúčinná kapalinová chromatografie nebo vysokotlaké kapalinové chromatografie je forma chromatografie s použitím vysokotlaké řídit rozpuštěných látek přes kolony rychleji. To znamená, že difúze je omezená a rozlišení je zlepšeno. Nejběžnější formou je“ obrácená fáze “ HPLC, kde je materiál sloupce hydrofobní.

proteiny jsou eluovány gradientem rostoucího množství organického rozpouštědla, jako je acetonitril. Proteiny eluují podle své hydrofobnosti. Po čištění HPLC je protein v roztoku, který obsahuje pouze těkavé sloučeniny a může být snadno lyofilizován. HPLC purifikaci často za následek denaturaci čištěné bílkoviny a je tedy použitelné pro proteiny, které nejsou spontánně znovu složte.