Výstavba Mito-jaderné introgression linky
izolovat genetické účinky mtDNA z jaderného genomu, naše experimenty byly založeny na mitonuclear introgression linky (MNILs). Konstrukce našich MNILs je podrobně vysvětlena v Kurbalija Novicic et al. . Stručně řečeno, všechny MNILs použity byly vytvořeny z isofemale linky (IFLs), z nichž každá byla založena jediným wild-shromážděné pářil samice pocházející od společného jednotného přírodní populace (Sicevo Soutěska-Srbsko, S 43°19’55.58″ N 22°0837.98″). Linky byly první genotyp pro jejich mtDNA haplotyp pomocí restrikční enzymy a vybrali jsme šest IFLs, z nichž tři se provádí AHOJ haplotypy a tři HII haplotypy, z nichž každý byl pak zpětně kříženy s společný sedmý IFL („D“). V každém MNIL, zpětným křížením bylo provedeno spárování 10 panny ženy z dané KDYBYCH s 20 muži z D-line. Použili jsme tento opakované introgressive zpětným křížením postup pro 12 dalších generací nahradit jaderného genomu daného KDYBYCH se společným outbrední D jaderného genomu (> 99.95% nahrazuje). Všimněte si, že IFLs nebyly inbrední nebo jinak vyrobené isogenic. Aby se vyloučila možnost kontaminace během introgrese, byla integrita mtDNA všech Mnil validována při generaci 5, 8 a 12 genotypizací vzorku much z každého MNIL. Jsme také vyšetřeni na přítomnost Wolbachia ve všech MNILs, PCR pomocí 16S rDNA Wolbachia-specifických primerů pomocí metody popsané v García-Martínez et al. . Jako pozitivní kontrolu jsme použili dva různé kmeny Drosophila obsahující Wolbachii (populace d. melanogaster č. 5, Bloomington Stock Centre, d. simulans, kmen Riverside). Tyto testy PCR byly negativní pro všechny naše MNILs i pro linii D. Všechny linie byly udržovány a všechny experimenty byly prováděny za konstantních laboratorních podmínek, při 19 °C, relativní vlhkosti 60%, světle 300 lx a při fotoperiodě 12 h světlo: 12 h tma.
Založení experimentální vývoj populace
Před experimenty, jsme se sloučil tři MNILs nesoucí AHOJ do jedné AHOJ zdrojové populace a tři HII MNILs do HII zdroj obyvatelstva homogenizujte potenciální jaderné genetické variability napříč MNILs. To bylo provedeno smícháním 100 dospělých mušek z každého MNIL, ve dvou populačních klecích (tj., N = 3 × 100 letí za klec) (Plexisklo klece, L25 cm x W15 cm xH15 cm, s 3 jídel, každý obsahuje 30 ml kukuřičná mouka) a udržování těchto pro jednoho následné plné generace za standardních laboratorních podmínek. Obě zdrojové populace tedy nesly buď HI nebo hii mtDNA haplotyp, vyjádřený v outbredním a společném jaderném genetickém pozadí (tj. Virgin létá z těchto dvou zdrojových populací pak byly vyzývavě a založila experimentální vývoj populace.
zahájili jsme N = 12 experimentálních evolučních populací. V každé populaci byly N = 100 panenských mušek (poměr pohlaví 1:1) ve věku 3-5 dnů zavedeny ze zdrojových populací do populační klece (L25 cm x Š15 cm xH15 cm). Jsme pestrá startovní frekvence HI a HII haplotypy a zdroj potravin podmínek celé populace, pomocí 2 × 2 zkřížené uspořádání (N = 3 populace na buňku), v následujícím způsobem. V polovině klecí bylo 80% zakládajících mušek ze zdrojové populace HI a 20% ze zdrojové populace HII. V druhé polovině 20% zakládajících mušek pocházelo ze zdrojové populace HI a 80% ze zdrojové populace HII. Pokud jde o podmínky potravinových zdrojů, množství média (objemově i povrchově) bylo ve dvou léčebných skupinách identické, zatímco v rámci populace byla změna koncentrace živin manipulována následovně. Polovina klecí (homogenní potravinové podmínky) obsahovala 3 identická jídla, každá s 30 ml standardního kukuřičného média (YC) obsahujícího 1, 5% kvasinek. Druhou polovinu klece (heterogenní jídlo podmínek) také obsahoval 3 jídel, každý s 30 ml standardního média, ale tyto se lišily v droždí koncentrace (YL-0.375%, YC – 1.5%, YH – 6%).
Údržba experimentální vývoj populace
Populace byly zachovány v laboratoři, a to způsobem, který zajišťuje diskrétní generace, 40 dny/cyklus , na 19 °C, relativní vlhkost 60% a 12 h světla: 12 h tmy. V den 40 byly tři staré pokrmy nahrazeny třemi novými a mouchy byly povoleny celkem 9 dní pro ovipozici . Nová jídla, obsahující vejce a larvy, byly poté vyčištěny od všech dospělých a přeneseny do nové klece, aby zahájily další generaci. Všechny dospělé mouchy v každé staré kleci byly poté počítány, jakmile byly mrtvé.
Sekvenování a mitogenome sestavy
Před haplotyp frekvence odhad (viz níže), jsme sekvenován a shromáždil všechny mtDNA haplotypy používá. DNA byla extrahována ze šesti if linií (HI: 1, 3, 5; HII: 21, 25, 29) použitých k vytvoření MNILs pomocí protokolu srážení soli a ethanolu. Mouchy byly nejprve jemně rozemletou a umístěny v přípravě pufru (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH = 8.0, o 0,5% SDS) spolu s proteinázu K, zamíchat na vortexu a inkubovány při 50 °C přes noc. Vzorky byly poté zmrazeny přes noc. K vysrážení DNA jsme několikrát přidali nasycený NaCl před přidáním 95% ethanolu a DNA jsme spřádali do pelet. Dna peleta byla suspendována v Te 4 pufru (pH = 7,6). DNA kvalita a kvantita byla hodnocena pomocí NanoDrop, Qubit a Bioanalyzer, následuje fragment, délka hodnocení na agarózovém gelu.
sekvenční knihovny byly připraveny ze 100 ng DNA pomocí přípravné sady TruSeq PCRfree DNA library. Šest vzorků bylo poté sekvenováno do 125 bp spárovaných koncových čtení ve dvou pruzích na systému Illumina HiSeq2500 pomocí sekvenční chemie v4. Celkem jsme pro každou knihovnu sekvenovali v průměru 194 milionů čtení. Mitogenomy ze šesti vzorků byly poté sestaveny pomocí 5% podmnožiny celkového počtu čtení z každé knihovny. Čtení byla přiváděna do algoritmu MITObim v 1.8 a Mira v 4.0.2 assembler, provádět řízené sestavy, pomocí mitogenomu Drosophila pseudoobscura (GenBank: FJ899745. 1) jako referenčního genomu. Všechny získané sestavy byly kruhové mitogenomy o velikosti téměř 16kbp. Konečné sestavy byly poté zarovnány pomocí ClustalW a MAFFT, a ručně kurátorem, aby se získala konečná leštěná sestava pro každý haplotyp. Sestavené mitogenomy byly anotovány pomocí DOGMA a MITOS, pomocí výchozího nastavení parametrů, a nakonec ručně kurátor.
posoudit platnost našich mitogenome montáž, všechny Drosophila subobscura mtDNA sekvence jsou k dispozici na GenBank (Cox1, Cox2, Cox3, Cob, Nad1, Nad2, Nad3, Nad5, rrnL, rrnS, A + T bohaté oblasti, a několik trna), celkem zahrnující více než 50% z celkové sestavy, byly vyrovnány proti naší mitogenomes. Bez výjimky vykazovaly > 99% sekvenční identitu.
Několik unikátních Snp byly nalezeny v každém ze šesti mitogenome haplotyp (viz níže), z nichž dvě důsledně odlišit HI a HII haplotyp skupiny. Hloubka pokrytí pro každý SNP byla ověřena mapováním zpětných čtení použitých pro sestavu mitogenomu pomocí Bowtie v 1.2 . Toto úsilí potvrdilo všechny SNP identifikované v kroku montáže. Zde se zaměřujeme na dvě hlavní haplotypové skupiny I a II, které vykazují výrazný a konzistentní vzorec polymorfismu uvnitř populace napříč populacemi (obr. 1) a funkční fenotypové rozdíly (viz Úvod). Ačkoli se SNP vyskytují v každé ze dvou haplotypických skupin, takové SNP jsou vzácné (např.) a nejsou konzistentně polymorfní.
Odhad mtDNA haplotyp frekvence
použili Jsme bazén-seq odhadnout haplotyp frekvence vývoj, sekvenování vzorků much z 5. a 10. generace z každé experimentální vývoj populace. V každém vzorku 105 náhodně vybraných mouchy v každé kleci byly sloučeny a podrobeny extrakci DNA (ve skupinách po 15) a sekvenování knihovna přípravky, jak je popsáno výše. Vzorky N = 24 byly poté sekvenovány na 125 bp spárovaných koncových čtení ve dvou pruzích na systému Illumina HiSeq2500 pomocí sekvenční chemie V4. Náš bazén-seq úsilí byl navržen tak, aby poskytnout dostatečné hloubky sekvenování pro přesný odhad mtDNA haplotyp frekvence, ale neumožňuje podrobné analýzy jaderného genomu.
sekvenovali jsme v průměru 66 milionů čtení pro každou knihovnu. Čtení z každé knihovny byla poté mapována zpět na šest sestavených mitogenomů, přičemž si zachovala pouze jedinečná mapování s nulovým nesouladem pomocí Bowtie v 1.2 . Počet čte mapování na dvě Modifikace, které rozlišují HI a HII typy (v Nad5 a 12S rRNA) pak byly spočítány a použity jako odhad relativní četnosti každé hlavní haplotyp (HI nebo HII) v každém vzorku.
statistické analýzy
pro každý vzorek byla všechna čtení mapovaná na dva diagnostické SNP (viz níže) počítána jako typ HI nebo typ HII. Podíl HI čtení pro dva různé SNP byl skutečně velmi úzce korelován napříč 24 vzorky (r = 0,987), takže oba markery poskytly prakticky identické odhady. Tady, použili jsme střední poměr mezi oběma SNP zde k odhadu frekvence HI přítomné v každém vzorku pool-seq.
Evolution může být definován jako změny v genotypu frekvence v populaci, a náš design nám umožnila odvodit dvě časově oddělené opakované opatření na generaci haplotyp změny frekvence v každé naší vyvíjející linie buď jako Δf0–5 = (f5 – f0)/5 nebo Δf5–10 = (f10 – f5)/5, kde dolní indexy označují generaci, při které byl vzorek odebrán. Kromě toho jsme odhadli Δf0-10 = (f10-f0) / 10 k posouzení čisté změny frekvence haplotypu. Protože pouze dva genotypy byly zapojeny, frekvence HI: fI = 1 – fII, a tak jsme omezit naše analýz pro změny frekvence jednoho z haplotypy. Pro každý odhad Δf, jsme také odvozen frekvenčně závislé selekce koeficient (SI), což odpovídá síle výběr požadované způsobit pozorované změny v haplotyp frekvence (viz níže).
každá vyvíjející se linie představuje v našem návrhu pozorovací jednotku, a proto jsme analyzovali naše data pomocí opakovaných měření ANOVAs (tj. Tady, každý řádek představuje téma, a počáteční frekvence HI (o 0,2 nebo 0,8) a environmentálního stavu (homogenní nebo heterogenní), byly dva mezi-předměty faktory, a dvě opakovaná měření (Δf nebo SI) přijatých v různých generačních intervalech bylo zacházeno jako v-předměty faktor. V těchto analýzách, kontaktním mezi-předměty faktory test pro účinky na naše experimentální léčby a v rámci předmětů faktor testy, zda model evoluce se změnilo během našeho experimentu. Tato analytická strategie upozorňuje na skutečnost, že budeme sledovat frekvenci dynamika v replikované a nezávislé linky a non-kontaktní účinek náhodný genetický drift, který je předpověděl být podstatné pro mtDNA dynamiku, tvoří část zbytkové termín naší inferenční modely. Konvenční F-testy faktorů mezi subjekty byly validovány pomocí permutačních testů založených na 9999 náhodných permutacích dat. Průměrné SI pro různé skupiny byly hodnoceny pomocí 95% CI z 9999 bootstrap replikátů dat.
Odhady síly závislé na frekvenci výběru
také Jsme si přáli, aby se více explicitně posoudí, zda je síla frekvence závisí výběr na HI a HII lišily napříč oběma životního experimentální léčby (homogenní / heterogenní). Abychom to umožnili, odvodili jsme z našich empirických dat jednoduchá měřítka výběru závislého na frekvenci pomocí následujícího zdůvodnění. Předchozí explicitní modelování non-experimentálních dat v tomto systému ukázaly, že nejlepší fit s haplotyp frekvence dynamických dat se vyskytuje tam, kde je žádné pozitivní nebo negativní selekce na tyto mtDNA haplotypy ale tam, kde je negativní frekvenčně závislé selekce, který je stejně silný na oba haplotypy . Zvažujeme dva mtDNA haplotypy HI a HII, s frekvencemi pI a pII (pI + pII = 1) a fitnesses WI a WII. Jednotlivé generace změnit v pI je dána vztahem
$$ \Delta {p}JÁ=\frac{p_I{p}_{II}\left({W}JÁ-{W}_{II}\right)}{\overline{W}} $$
Pozorování z přírodních populací (viz Obr. 1; Doplňující soubor 1) a replikovány laboratorní klece populace také naznačují, že výběr je symetrické rovnováhy pro dva haplotypy HI a HII v blízkosti pI = pII = 0.5. Za předpokladu (i) rovnovážné frekvence pI = pII = 0.5, (ii) že haplotyp fitness je přímo úměrná haplotyp frekvence a (iii) že výběr je symetrické, z nichž všechny jsou podporovány předchozí studie , můžeme dosáhnout
$$ {W}došlo mi,=1-{p}JÁ{s}JÁ $$
$$ {W}_{II}=1-{p}_{II}{s}JÁ $$
kde sI je frekvence závislá výběr koeficientu. Vzhledem k tomu, že \( \overline{W}={p}JÁ{W}JÁ+{p}_{II}{W}_{II} \), můžeme pak odhadnout sI z naší empirické pozorování ΔpI jako
$$ {s}JÁ=\frac{-\Delta {p}JÁ{p}JÁ-\Delta {p}JÁ{p}_{II}}{-\Delta {p}Došlo mi, {p_{II}}^2-{p_I{p}_{II}}^2+{p_I}^2{p}_{II}-\Delta {p}JÁ{p_I}^2} $$
Definováno tímto způsobem, sI přebírá libovolný měřítku, ale je pozitivní, když o ΔpI změny směrem k atraktor a negativní, kdy se mění od atraktor. Pro každou klec jsme odhadli dvě nezávislá opakovaná měření sI na základě pozorovaných změn frekvence haplotypu mezi generacemi 0-5 a 5-10. Všimneme si, že naše míra bude přesná, když je skutečná rovnováha blízko pI = pII = 0,5, ale přibližnější, pokud se skutečná rovnováha odchýlí od této podmínky.
