ABSTRAKT
neuraminidázy Chřipkového viru (NA) hraje zásadní roli při uvolňování a šíření potomstva virionů, po intracelulární cyklu replikace viru. Abychom otestovali, zda NA může také usnadnit vstup viru do buňky, infikovali jsme kultury lidského epitelu dýchacích cest viry lidské a ptačí chřipky v přítomnosti inhibitoru na oseltamivir karboxylát. Dvacet až 500krát méně buněk bylo infikováno v léčených versus neléčených kulturách (P < 0,0001) 7 h po aplikaci viru, což naznačuje, že lék potlačil zahájení infekce. Tyto údaje ukazují, že virová NA hraje roli na počátku infekce a poskytují další zdůvodnění profylaktického použití inhibitorů NA.
To je věřil, že hlavní funkcí virové neuraminidázy (NA), je v konečné fázi infekce, kdy štěpí NA kyseliny sialové z buněčného povrchu a potomstvo virionů usnadnění virus uvolní z infikované buňky (1, 2). Méně je známo o funkcích NA během vstupu viru do buňky. Dlouho se předpokládalo, že NA podporuje přístup viru k cílovým buňkám v dýchacích cestách degradací hlenu (3). Tento koncept však nebyl nikdy formálně prokázán kvůli nedostatku adekvátního experimentálního systému. Kromě toho byly hlášeny některé důkazy argumentující proti úloze NA v raných stádiích infekce(přezkoumáno v odkazu 2).
k řešení tohoto problému jsme studovali účinky inhibitoru na oseltamivir karboxylát (OC) (9) na vstup viru chřipky do kultur lidského epitelu dýchacích cest. Primární lidské tracheobronchiální epiteliální buňky (HTBE; Klonetika) a primární nosní epiteliální buňky (PromoCell GmbH) byly pěstovány na membránových podpěrách (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) na rozhraní vzduch-kapalina v růstovém faktoru bez séra a médiu doplněném hormony (6, 8). Pro všechny experimenty byly použity plně diferencované 4 – na 8týdenní kultury. Tyto kultury byly pseudostratified a polarizované; obsažené bazální, řasinkový, a hlenu secernujících buněk, a podobaly lidské dýchacích cest epitelu in vivo (Obr. 1). OC (1 µM, pokud není uvedeno jinak) byl přidán do virové suspenze a na bazolaterální prostory kultur krátce před infikování dva replikovat kultury z apikální straně. Dvě kontrolní kultury byly infikovány v nepřítomnosti inhibitoru. Jednu hodinu po infekci jsme odstranili inokulum viru a inkubovali kultury na rozhraní vzduch-kapalina po dobu dalších 6 hodin, aby se umožnila replikace intracelulárního viru. Kultury byly následně opraveny, a infikované buňky byly identifikovány barvení s polyklonální antiséra celý viry následuje odpovídající peroxidázy značené sekundární protilátky (Dianova) a aminoethylcarbazole substrátu (Sigma). Pozitivní barvení indikovalo úspěšný vstup viru do buňky. Kultury byly analyzovány en tvář při zvětšení ×300 (Olympus IMT-2). Celkový počet buněk exprimujících virové antigeny se počítá v epiteliálních segmentu, který zahrnoval všechny po sobě jdoucí mikroskopické pohledy (0.28 o 0,42 mm) podél průměr kultury (segment plocha, 3 mm2, počet buněk na segment, asi 30.000). Čtyři segmenty, z každé kultury byly počítány otáčením kultura ve směru hodinových ručiček o 45°. Data pro osm segmentů dvou replikovat kultury byly v průměru.
Ve dvou experimentech s použitím HTBE kultur, lidského viru A/Memphis/14/96 (H1N1) infikovaných 22 – a 65-krát méně buněk v přítomnosti NA inhibitor v porovnání s kontrolami (Obr. 2; Tabulka 1) (P < 0,0001). Viry A/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) z volně žijících vodních ptáků a/Turecko/Itálie/2379/99 (H7N1) z domácí drůbeže byly také výrazně citlivé na OC v těchto kulturách. V nosních epiteliálních kulturách OC snížil infekci virem člověka 120 a 520krát. Tyto výsledky ukázaly, že inhibice virového NA potlačuje zahájení virové infekce.
/Kuřecí/Německo/R28/03 (H7N7) patří k vysoce patogenní virus influenzy ptáků rodu, který způsobil vypuknutí ptačí mor v komerčních chovech drůbeže v Nizozemsku, Belgii a Německo v roce 2003. Tyto viry jsou přenášeny nejméně 89 lidí, z nichž většina prezentovány s zánět spojivek, ale jeden smrtelný případ pneumonie došlo také (5). Infekce kuřecím virem H7N7 v kulturách HTBE byla snížena 140-a 40-krát v přítomnosti 1 a 0,1 µM OC. Tyto koncentrace představovaly typické plazmatické maximální a minimální koncentrace léčiva dosažené u lidí po podání 75 mg oseltamivir fosfátu, doporučené dávky pro profylaxi (9).
potvrdit hypotézu, že infekce inhibice v našich experimentech byla přímo vztahující se k inhibici virové NA enzymatickou aktivitu, použili jsme lidské A/Sydney/5/97-jako virus a (H3N2) a jeho oseltamivir-rezistentních mutant s R292K střídání v NA, která se vykreslí NA 9,000-krát méně citlivá k inhibici tím OC (4). V souladu s hypotézou, rodič lidský virus byl silně inhibován OC, vzhledem k tomu, že pouze marginální úrovni inhibice rezistentních mutantů byla pozorována, když oba viry byly testovány ve stejném experimentu v HTBE kultur (Tabulka 1). Dosud nebyl k dispozici žádný adekvátní test buněčné kultury pro monitorování rezistence viru chřipky na inhibitory NA z důvodu nesouladu mezi receptory kyseliny sialové u lidí a v konvenčních laboratorních buněčných liniích (9, 11). Naše výsledky naznačují, že diferencované kultury lidského epitelu dýchacích cest mohou být vhodným systémem buněčné kultury pro detekci rezistence viru chřipky na inhibitory NA.
konečně, použití drogy citlivé A / Sydney/5/97-stejně jako virus jsme testovali inhibici infekce OC přidaným v různých časech po inokulaci viru. Zatímco při přidání léku krátce před infekcí bylo infikováno 47krát méně buněk, 1-h zpoždění kromě OC vedlo k pouze 1,5 násobné inhibici s ohledem na neošetřenou kontrolu (Tabulka 1). Pokud bylo léčivo Přidáno 4 hodiny po inokulaci viru, nebyla pozorována žádná statisticky významná inhibice. Tyto údaje naznačují, že OC ovlivnil nejranější stadia infekce před replikací viru.
stručně řečeno, poskytli jsme tu poprvé přímé experimentální důkazy o zásadní roli NA ve fázi virus invaze řasinkami epitelu lidských dýchacích cest. Na funkci v této fázi je velmi pravděpodobné, že odstranění decoy receptory na muciny, řasinky, a mobilní glycocalix, silná vazba na každou, která by bránila virus přístup k funkční receptory na povrchové membráně cílových buněk. Nicméně, NA další funkce—například podpora hemaglutinin-zprostředkované fúze (7)—nelze vyloučit, a další studie jsou zapotřebí k určení přesné mechanismy, které NA podporuje virus vniknutí do dýchacích cest epitelové buňky.
zatím není k dispozici žádná vakcína proti vysoce patogenním virům influenzy ptáků H7N7 a H5N1, antivirová léčiva zůstávají jedinou možností boje proti ptačí chřipce (10). Ve srovnání s jinými látkami proti chřipce jsou inhibitory NA dobře snášeny a účinné proti všem kmenům virů chřipky A A B. Existuje jen málo důkazů o vzniku virové rezistence a infekčnost mutantních virů je obvykle ohrožena (9, 11). Schopnost inhibitorů NA potlačit infekci před vstupem viru do buněk podtrhuje jejich vysoký potenciál pro preventivní opatření. Zejména naše údaje poskytují vědecký základ pro podporu profylaktického použití těchto sloučenin u osob s vysokým rizikem infekce viry influenzy ptáků.
