Stručný Úvod: Filtrační Techniky
Blotting se používá v molekulární biologii pro identifikaci proteinů a nukleových kyselin a je široce používán pro diagnostické účely. Tato technika imobilizuje molekulu zájmu na nosiči, což je nitrocelulózová membrána nebo nylon. Používá hybridizační techniky pro identifikaci specifických nukleových kyselin a genů.
technika blotování je nástroj používaný při identifikaci biomolekul, jako je ad DNA, mRNA a protein během různých stadií genové exprese. Syntéza proteinů zahrnuje expresi segmentu DNA, který se převede na mRNA za vzniku příslušného proteinu.
podtypy blotování, jako je severní, západní & Jižní, závisí na cílové molekule, která je hledána. Pokud je sekvence DNA základem nebo kódem molekuly proteinu, může být konkrétní molekula DNA, která je předmětem zájmu, blotována pomocí techniky Southern Blotting. Během genové exprese, kdy je DNA exprimována jako mRNA pro produkci proteinu, lze tento proces identifikovat severním blotováním. Nakonec kódovaná mRNA produkuje dotyčný protein, tuto identifikaci proteinu lze provést západním blotováním.
obecný postup pro blotování
- Homogenizujte vzorek.
- separace zajímavé molekuly elektroforézní membránou.
- přenos molekul na nitrocelulózovou membránu / nylonovou membránu.
- Hybridizace nebo identifikaci molekuly,
Northern Blotting
Northern Blotting je technika používaná pro studium genové exprese. To se provádí detekcí konkrétní RNA (nebo izolované mRNA). mRNA je obecně reprezentována jako 5% celkové RNA sekvence. Tato metoda odhaluje identitu, počet, aktivitu a velikost konkrétního genu. Tato technika blotování může být také použita pro růst tkáně nebo organismu. V různých stádiích diferenciace a morfogeneze se hojnost RNA mění, což lze pomocí této techniky identifikovat. Pomáhá také při identifikaci abnormálního, nemocného nebo infikovaného stavu na molekulární úrovni. Technika northern blot byla vyvinuta v roce 1977 Jamesem Alwinem, Davidem kempem a Georgem Stankem na Stanfordské univerzitě. Technika dostala své jméno kvůli podobnosti procesu s jižním blotováním. Primární rozdíl mezi těmito dvěma technikami spočívá v tom, že severní blotování se týká pouze RNA.
princip
jako všechny normální blotovací techniky začíná northern blotting elektroforézou k oddělení vzorků RNA podle velikosti. Elektroforéza odděluje molekuly RNA na základě náboje nukleových kyselin. Náboj v nukleových kyselinách je úměrný velikosti sekvence nukleových kyselin. Membrána elektroforézy tedy odděluje sekvenci nukleových kyselin podle velikosti sekvence RNA. V případech, kdy je naší cílovou sekvencí mRNA, může být vzorek izolován pomocí chromatografických technik oligo celulózy, protože mRNA je charakterizována poly (a) – ocasem. Protože molekuly gelu jsou křehké povahy, oddělené sekvence se přenášejí na nylonové membrány. Výběr nylonové membrány přispívá k faktoru, že nukleové kyseliny jsou v přírodě negativně nabité. Jakmile jsou molekuly RNA přeneseny, je imobilizována kovalentní vazbou. Sonda se pak přidá, sonda může být komplementární sekvenci ss DNA. Formamid se obecně používá jako savý pufr, protože snižuje teplotu žíhání.
postup
- odebraný vzorek tkáně nebo kultury se nejprve homogenizuje. Vzorky mohou být reprezentativní pro různé typy kultury pro srovnání nebo mohou být pro studium různých fází růstu uvnitř kultury.
- sekvence RNA je oddělena v elektroforézní jednotce pro účely separace nukleových kyselin se používá agarózový gel.
- nyní se oddělená sekvence RNA přenáší na nylonovou membránu. To se provádí dvěma mechanismy kapilárního působení a iontové interakce.
- přenosová operace se provádí udržováním gelu v následujícím pořadí. Nejprve se agarózový gel umístí na dno stohu a následuje blotovací membrána. Na tyto Papírové ručníky je umístěna mírná hmotnost (skleněná deska). Celé nastavení je uchováváno v kádince obsahující vyrovnávací paměť.
- RNA přenesená na nylonovou membránu se pak fixuje pomocí UV záření.
- pevná nylonová membrána se pak smísí se sondami. Sondy jsou speciálně navrženy pro gen, tak, že se bude křížit s RNA sekvencí na skvrnou odpovídající pořadí zájmu.
- blot membrána se promyje, aby se odstranil nežádoucí sonda
- Značené sondy je detekován pomocí chemiluminiscence nebo autoradiografie. Výsledkem budou tmavé pruhy v rentgenovém filmu.
GEl a Sondy
RNA vzorky jsou odděleny pomocí agarózového gelu pomocí formaldehydu jako denaturační činidla, ale v malých RNA nebo mikro RNA sekvence, polyakrylamidovém sekvence s močovinou jako denaturační činidlo mohou být použity také. Ethidiumbromid může být použit jako barvivo. Dva typy značek jsou určeny pro označení velikosti. RNA žebřík a ribozomální podjednotka se používají pro identifikaci velikosti sekvencí RNA.
sondy mohou být komplementární k celé nebo části RNA zájmu. Mohou to být RNA, DNA nebo oligonukleotidy 25 komplementárních bazických párů k cílové RNA. V případě RNA sond se používají sondy vyrobené invitro, protože sondy invivo mohou denaturovat kvůli přísnému praní. V případě cDNA jsou sondy označeny radioaktivními izotopy, alkalickou fosfatázou nebo křenovou peroxidázou v případě chemiluminiscence.
