Onkologie Zprávy

Úvod

i když román terapie v poslední době beenintroduced do klinické praxe pro léčbu advancedprostate, rakoviny prostaty, rakoviny zůstal druhý deadliestcancer u mužů ve Spojených Státech v roce 2014 (1). Nové terapeutické cíle a strategiejsou naléhavě potřebné k dalšímu zlepšení klinického výsledkupacientů s rakovinou prostaty.

jedním slibným potenciálním terapeutickým cílem jecyklin-dependentní kináza 5 (CDK5). CDK5 je serin / threonin kinasestrukturně podobný jiným CDK (2). Zdá se, že CDK5 nemá většinurole v regulaci buněčného cyklu (3,4). Má být dobře charakterizovány pro svou dominantní roli v rozvoje centrálního nervového systému, včetně role inneuronal migrace, diferenciace a přilnavost (5,6). Mya další následně ukázali, že CDK5 hraje důležitou rolivývoj rakoviny a metastázy (7-12). V rakovinných buňkách prostaty jsme prokázali, že CDK5 byl kritický procytoskeletální integritu, migraci a invazi buněk a invivo pro metastázy (7). Inpancreatic rakoviny, CDK5 je neoddělitelnou KRAS signalizace přes thecentrally důležité RAL transdukce signálu cestou, tedy zajištěním potenciál druggable cíl pro mutovaný KRAS nádory (8). Dohromady tyto studie ukazují, thatinhibition z CDK5, samostatně nebo v kombinaci s jinými látkami, mayprovide efektivní léčebné strategie pro tyto a othercancer typy.

v této studii jsme se rozhodli identifikovat činidlakteré by byly zvláště účinné v kombinaci s Cdk5inhibicí v buňkách rakoviny prostaty. Proto jsme provedli ascreen Johns Hopkins Drug Library (JHDL). Jhdl je sbírka 3 360 farmaceutických sloučenin, které úspěšně dokončily testování bezpečnosti u lidí pro různé aplikace (13,14). Tato knihovna byla usedsuccessfully pro využití sloučenin pro terapii rakoviny,včetně identifikace digoxinu jako HIF1a inhibitor (15), a itrakonazol jako angiogenesisinhibitor (16). Jsme previouslyemployed na JHDL identifikovat cetrimoniumbromid a irinotekan ascompounds se zvýšenou protinádorovou aktivitu proti prostaty cancercells vyjadřující nízkou úrovní metastáz supresorového genu N-mycdownregulated gen 1 (NDRG1) (17).Zde jsme provedli podobný screening JHDL s karcinomem prostaty, které se liší aktivitou CDK5. Tiloron byl identifikován jako sloučenina s buňkami rakoviny prostaty s deficitem in vitro syntetické letality inCDK5.

materiály a metody

buněčná kultura

PC3 buněčné linie karcinomu prostaty byly získány z matcc. Tyto buňky jsou odvozeny z kostní metastázy od 62letého pacienta s rakovinou prostaty. Lidské fibroblasty prostaty, laskavěposkytované Dr. J. Isaacsem, byly získány z biopsie prostaty u 62letého pacienta s rakovinou prostaty s gleasonovým skóre 4. Obě buněčné linie byly pěstovány a udržovány v médiu RPMI-1640 (Invitrogen)doplněném o 10% fetální hovězí sérum. Buňky byly kultivovány ve zvlhčeném inkubátoru při 37°C v 5% Co2atmosféře.

Vytvoření PC3 CDK5dn buněčné linie

Ztráta CDK5 funkce bylo provedeno v PC3 cellsby transfekce dominantní negativní konstrukt obsahující D144Nmutation, laskavě poskytl Dr. L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Použitý protokol bylpopsáno dříve (7). Stručně řečeno,konstrukt byl subcloned v obousměrné Tet vektor, pBI-EGFP(BD Biosciences), který měl zeocin gen rezistence přidáno forselection (laskavě poskytl Dr. K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School of Medicine). prázdný vektor PBI-EGFP nebo vektor pBI-EGFPCDK5dn byl transfektován do buněk PC3, které obsahovaly konstrukt promotoru atet-Off, pTTa (Bd Biosciences).

Západní blotování

Západní blotování bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve (19). Na gel bylo naloženo deset mikrogramů proteinu. Primární protilátky byly rozpuštěnyblokovací pufr . Bylo použito ředění 1: 1 000 pro anti-CDK5 (Sigma-Aldrich); anti-vinkulin (Millipore, Upstate)byl zředěn 1: 4 000. Sekundární protilátky byly zředěny na ředění v poměru 1: 4 000. Normalizace intenzity pásma byla prováděna s housekeeperem proteinem vinkulinem. Vyvinuté bloty bylykonzervovány pomocí skeneru Microtek.

test hojení ran

testy hojení ran byly provedeny pomocí kontroly confluentPC3 (obsahující prázdný vektor PBI-EGFP) nebo PC3 CDK5dncells. K seškrabání oblasti byla použita gumová škrabka. Lehké mikroskopické snímky byly pořízeny okamžitě a 24 hafter škrábání.

screening knihovny s malými molekulami

knihovna JHDL byla popsána dříve (13,14,17).Skladování a screening sloučenin JHDL byly provedeny, jak bylo popsáno dříve (17).Krátce byly buňky PC3 control a CDK5dn naočkovány do 96 jamkových destiček (1×103 buněk / jamka) a ponechány přes noc. Pak5 µl léčiv, uložených jako zásobní roztoky 200 µM inDMSO / H2O, bylo přidáno do kompletního RPMI média, takže buňky byly ošetřeny v konečné koncentraci 10 µM. Po 48 hodinách léčby bylo ke každému z nich přidáno 20 µl činidla MTS z testu proliferace AqueousNon-radioaktivních buněk CellTiter 96™ po dobu 2-4 hodin při teplotě 37°C. Desky byly analyzovány pomocí čtečky desek aSoftMax Pro (molekulární zařízení). Proliferace léčených buněk byla porovnána s proliferací buněk PC3CONTROL nebo CDK5dn ošetřených DMSO (proliferační index). Proliferationindices PC3 CDK5dn buněk byly porovnány s proliferationindices PC3 kontrolních buněk. Studie PubMed byla provedena za účelem posouzení klinického využití potenciálních hitů.

testy MTS

byly provedeny testy MTS k měření antiproliferativního účinku léčby tiloronem. Tiloronedihydrochlorid (Sigma-Aldrich) byl skladován jako 10 mM zásobní roztok v DMSO při -20°C. Tisíc buněk PC3 bylo pokoveno96-jamkové desky obsahující 100 µl kompletního RPMI média. Při přibližně 50% soutoku byl podán Tiloron dihydrochlorid. Proexperimenty byla sloučenina zředěna v úplném RPMI médiu, aby se dosáhlo požadované konečné koncentrace. Po léčbě po dobu 72 hodin (monoterapie tiloronem) bylo přidáno MTS činidlo a absorpce při 490 nm byla stanovena pomocí čtečky desek SoftMax Pro.Byly vypočteny indexy proliferace; jako acontrol byly použity neošetřené kontrolní buňky PC3 orCDK5dn (v 103 µl kompletních RPMI médiích). Studentovy t-testy byly provedeny k posouzení p-hodnot.

Klonogenní testy

Klonogenní testy byly provedeny za účelem posouzení dlouhodobého přežití po léčbě tiloronem. Buňky rakoviny prostaty bylyplát do 60 mm nádobí a nechá se přilnout. Na 50-60% konfluence byly buňky ošetřeny tilorone za 72 h. Následně,1×103 buněk z každé misky byly umístěny v trojím vyhotovení in60-mm jídla a inkubovány v kompletním RPMI média na 12 dní.Kolonie byly fixovány a obarveny roztokem obsahujícím 90% methanolu a 10% roztok krystalové fialové (2,3% krystalové fialové, 0,1% oxalátu amonného a 20% ethylalkoholu; Sigma). Kolonie byly skenovány počítačovým skenerem (Microtek) a počítány ručně.Studentův t-testy byly provedeny posoudit, zda se jasně buněčných liniích byly statisticky významné.

3D růstový test

3D růstové testy byly provedeny za použití sameprotocolu, jak bylo popsáno výše (17). Stručně řečeno, toroidy byly generovány byculturing PC3 buněk pro 16 h jako visící kapku přes humidifiedplate v CO2 inkubátoru v kompletním RPMI mediacontaining 0.5% methylcelulóza. Sféroidy byly vloženy do kolagenové matrice (Bd Biosciences), ošetřeny tiloronem a zobrazenypomocí mikroskopu Nikon Eclipse Ti (Nikon) v den léčby a šest dní po zahájení léčby. Sféroidní a celkové (spheroidplus klíčky) plochy byly měřeny s ImageJ. Násobně zvyšuje werecalculated dělením hyperboloidu/celková plocha na den 6 thespheroid/celková plocha v den 0 pro každé jednotlivé hyperboloidu. Pro každou čarou a časovým bodem bylo zprůměrováno násobné zvýšení čtyř sféroidů. Statistické analýzy byly provedeny pomocí studentských testů.

Výsledky

Potlačení CDK5 aktivity

PC3 buňky rakoviny prostaty, které byly vybrány pro JHDLcompound obrazovku kvůli jejich vysoce metastazující potenciál andandrogen nezávislosti, čímž připomínající agresivní metastaticcastrate-rezistentní karcinom prostaty. Aktivita CDK5 byla inhibovánatransfekce a selekce dominantní negativní mutace (CDK5144N). Tyto buňky PC3 CDK5dn měly vyšší hladinu proteinu totalCDK5 ve srovnání s kontrolními buňkami PC3 (buňky PC3 transfektované prázdným vektorem) (obr. 1A). Test hojení ran (8) potvrdil, že CDK5 byl v těchto buňkách funkčně neaktivní; na rozdíl od buněk PC3control neměly buňky PC3 CDK5dn schopnost napadnout poškrábanou plochu povrchu (obr.1B).

Knihovna obrazovky pro sloučeniny targetingPC3 buněk na základě CDK5 aktivity

screeningu S vysokou propustností assay byla provedena toselect sloučeniny, které se zaměřují PC3 buněk na základě CDK5 činnosti. PC3control a CDK5dn buňky byly ošetřeny všemi sloučeninami theJHDL při 10 µM po dobu 48 hodin. Identifikovat zásahy, které se selektivně zaměřujípc3 buňky založené na expresi CDK5, vybrali jsme všechny sloučeniny vkterý poměr indexu proliferace (CDK5dn/kontrola) byl nižší než 0,5 nebo vyšší než 1,5 (obr. 2A).Kromě toho hits musel inhibovat buněčnou proliferaci buněk PC3 nejméně o 10%, protože jsme se konkrétně zajímali o sloučeniny, kteréinhibovaly růst buněk (horizontální a vertikální čára v grafu). Také jsme vybrali všechny sloučeniny, které inhibovaly proliferaci buněk v buňkách PC3 o 70% (levý dolní roh grafu), protože jsme měli zájem identifikovat potenciální vysoce účinné protinádorové látky. Celkem bylo pro další vyhodnocení vybráno 41 zásahů.

sekundární displej bylo provedeno ve kterém selectedhits z primární obrazovky bylo přidáno 10 µM po dobu 48 h PC3control a CDK5dn buněk v trojím vyhotovení, aby se zbavili falešných kladných výsledků (Obr. 2B). Mezní hodnoty byly o něco méně přísné než na primární obrazovce; sloučeninybyly považovány za hit, když byl poměr indexů proliferace (CDK5dn / control)nižší než 0,7 nebo vyšší než 1,4. To mělo za následek identifikaci tří sloučenin, které se selektivně zaměřujícdk5-exprimující PC3 buňky: rutilantin, ethakridin laktát acetalkoniumchlorid (obr. 2C).Tyto sloučeniny nebyly použity jako protinádorová činidla a jejich klinické použití jako intravenózní protinádorová činidla se jeví jako omezené (20-23). Další sloučenina, tilorone analogR9536-DA, byl vysoce účinný v inhibici obou izogenní PC3 celllines (>70% inhibice), ale inhibuje proliferaci PC3CDK5dn buňky poněkud více efektivně (poměr CDK5dn/ovládání:0.687). Tiloron a jeho analogy mají antivirovou aktivitu, působí alespoň částečně jako induktory interferonu (24-26) a bylo prokázáno, že předklinicky a klinicky mají také protinádorovou aktivitu (27,28).

Tilorone selektivně cílí na PC3 buňky s nízkou aktivitou CDK5

pokračovali jsme v experimentech s čerstvě rozpuštěným dihydrochloridem. Po 72 hodinách léčby tiloronem v různých koncentracích byl jeho IC50 stanoven při 8-12µM v buňkách PC3 CDK5dn a 15 µM v kontrolních buňkách PC3 v testech MTS(obr. 3A). Při 8 µM byla proliferationaktivita snížena o 24 a 47% v PC3 control a CDK5dncells (P=0,001). K posouzení toxicity tiloronu vnormálních buňkách prostaty byly provedeny testy MTS s tiloronemléčbou lidských fibroblastů prostaty (obr. 3B). Citlivost těchto buněk totiloronu byla podobná citlivosti kontrolních buněk PC3.

inhibiční účinek tiloronu v buňkách PC3 byl dále hodnocen prováděním klonogenních testů (obr. 3C). PC3 CDK5dn buňky byly také výrazně citlivější než PC3 kontrolní buňky na Tiloron v tomto testu. Léčba 10 µM tiloronem měla za následek klonogennípřežití 40% v buňkách PC3 CDK5dn a 72% v kontrolních buňkách PC3 (p=0,002).

byl proveden test růstu sféroidů k posouzení růstu 3dtumoru a invaze buněk PC3 po léčbě tiloronem(obr. 4). Jak PC3 control, tak PC3CDK5dn buňky měly srovnatelné zvýšení velikosti sféroidů během šesti dnů. Nicméně, celková velikost (velikost toroidy plus kapusta) hada vyšší násobné zvýšení PC3 kontrolní buňky, potvrzení thatuntreated PC3 CDK5dn buněk se sníženou invazivní potenciál vesrovnánís na PC3 kontrolní buňky. Když byl Tiloron podán v 5µM, kontrolní sféroidy PC3 měly podobný růstový a invazivní vzorec jako neošetřené kontrolní buňky PC3 (p=0,59) (obr. 4B, levý graf). Nicméně, whentilorone byl podáván ve stejné koncentrace PC3 CDK5dncells, významný pokles v obou kulovitý velikost a celkové sizewas pozorované (p<0.01), což naznačuje, že tilorone successfullyinhibits kulovitý růst a invazi PC3 CDK5dn buňky whenadministered na 5 µM (Obr. 4B, pravý graf). Při 10 µM měly obě izogenní buněčné linie sníženéinvazivní potenciál.

Diskuse

JHDL, knihovna dobře characterizedpharmaceutical sloučenin, byla vyvinuta s cílem usnadnit drugrepurposing studie (29). Rozsáhlá toxicita in vivo a farmakokinetické profily sloučenin v knihovně umožňují rychlý následný vývoj těchto sloučenin. Několik sloučenin z JHDL bylo pokročilov klinických studiích rakoviny a dalších terapeutických aplikací(13,14,16,17,30-32–.

v této studii jsme zkoumali JHDL sloučeniny, které diferenciálně inhibují růst nádorových buněk v přítomnosti inhibice CDK5; tilorone a tilorone analogové nedostatků jako látky, které selektivně cíl CDK5-nedostatečné PC3prostate rakovinné buňky. Tiloron (Amixin IC) se používá klinickyv některých zemích jako perorálně aktivní antivirové činidlo (25). Tilorone byl testován u lidípro léčbu mozkových gliomů, laryngeální papilomatózy arakovina prsu (28,33,34).Přestože byla hlášena protinádorová účinnost, zájem o léčbu přípravkem tilorone forcancer ustoupil. Nedávno hlásili Zhou et alnové analogy tiloronu se zlepšenou protinádorovou aktivitou (35). Tyto analogy mohou být slibnéexamin, zejména v kombinaci s inhibicí CDK5.

kromě možnosti, že tilorone může bepromising v kombinaci s inhibice CDK5, identificationof tilorone jako agent, který selektivně cílů buňky withinactive CDK5 naznačuje potenciální tříd léků zesilují theefficacy z inhibice CDK5. Tiloron byl charakterizován jako induktor interferonu (24). To naznačuje, že samotný interferon nebo alternativní interferoninducer, jako je agonista TLR, mohou být užitečné v kombinaci s inhibitorem aCDK5. Mohou se však jednat o další mechanismy. Například Tiloron je také interkalační činidlo DNA (24) a lze si představit, že může Modifikovat strukturu chromatinu a genovou expresi. Mohou být zapojeny i další funkce tiloronu, včetně signální dráhy a transkripčního faktoruinterakce (36,37). Další studiejsou potřebné k odhalení přesného mechanismu účinku, jímž se Tiloron selektivně zaměřuje na CDK5-negativní rakovinu prostatybuňky.

poděkování

autoři chtějí poděkovat profesorům P. J. Van Diestandovi e. Van der Wall za jejich podporu a diskusi a profesory.A. Carducci a J. T. Isaacs pro jejich poskytování laboratořemateriálů. Tato studie byla podpořena Letuška MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 a NCI SPORE grant P50 CA58236. M. D. W. byl podporován programem Dr. Saal van Zwanenbergstichting a HuygensScholarship.