PMC

1Detailed protokoly a tipy pro řešení problémů pro všechny aspekty GST gene fusion protein expression systému jsou k dispozici od GE Healthcare v příručkách: GST Gene Fusion System, číslo produktu 18-1157-58, a Rekombinantní Protein Příručky, produktové číslo 18-1142-75. Příručky jsou k dispozici ke koupi v tištěné podobě nebo jsou přístupné jako PDF na webových stránkách GE Healthcare.

2použití jm105 nebo podobného kmene se doporučuje pro klonování a údržbu vektoru. Pro maximální expresi proteinu se doporučují kmeny BL21 a jeho derivátů nebo jiný kmen s deficitem proteázy. Kmeny deficientní v cytoplazmatických proteáz genových produktů, jako je lon, ompT, degP nebo htpR může minimalizovat účinky proteolytické degradaci protein nadměrně exprimován u hostitele. Nepoužívejte kmen E. coli, který nese alelu rec1A k šíření plazmidů pGEX, protože byly hlášeny delece nebo přeskupení plazmidové DNA.

3glutathion Sepharose 4B sypké médium se používá v tomto purifikačním protokolu. Toto chromatografické médium je ideální pro screeningové podmínky a umožňuje snadné škálování. Očista se provádí snadno pomocí buď samospádem nebo nízkotlaké chromatografie systému, nebo může být použit v dávkovém purifikace založené na centrifugaci. Afinitní kolony GSTrap FF jsou 1 ml nebo 5 ml předbalené kolony, které jsou také k dispozici a mohou být zapojeny do série pro zvětšení. Tyto kolony jsou určeny pro použití s kapalinovým chromatografickým systémem, čerpadlem nebo stříkačkou. Kromě těchto formátů, glutathion Sepharose je k dispozici také v spin sloupce a 96-well plate formáty pro rychlý screening GST fúzní protein exprese a purifikace podmínky.

4DFP je extrémně nebezpečný neurotoxin. Dodržujte bezpečnostní opatření dodaná výrobcem a s čistým činidlem manipulujte pouze v chemickém digestoři.

5přidání inhibitorů proteázy do lýzního pufru pomůže zabránit proteolytické degradaci cílového proteinu během extrakce. Přesný koktejl inhibitorů proteázy přidaných do lyzačního pufru by však měl být přizpůsoben charakteristikám cílového proteinu. Redukční činidla jako 2-ME, DTT nebo TCEP v koncentracích 1-10 mM by měla být podle potřeby přidána do pufru. Přidání neiontového detergentu, jako je 1% Triton X-100, může být také přidáno do pufru, aby se napomohlo extrakci.

6Following je screeningový protokol pro kontrolu hladin exprese proteinu fúzního proteinu v minikulturách. Přítomnost zvýšení hladin bílkovin při očekávané molekulové hmotnosti na gelu SDS-PAGE po indukci IPTG je dobrou známkou úspěšné exprese proteinu. Po indukci by mělo být viditelné prominentní pásmo s očekávanou molekulovou hmotností (molekulová hmotnost cílového proteinu + ~ 26 KDa pro skupinu GST). Pokud existuje podezření, že protein je exprimován na nízké úrovni, ověření správné exprese lze provést pomocí Western blotting s protilátkou specifickou pro cílový protein nebo GST. Pokud vzorky nebudou okamžitě analyzovány pomocí SDS-PAGE, mohou být skladovány přes noc při 4 °C nebo při -20 °C pro dlouhodobější skladování.

1. naočkujte několik izolovaných kolonií do samostatných 50 ml odstředivkových zkumavek obsahujících 10 ml LB doplněných ampicilinem 100 µg / ml. Pěstujte přes noc kulturu při 37 °C s třepáním.

2. následující ráno přidejte 0, 5 ml noční kultury na 4, 5 ml LB se 100 µg/ml ampicilinu. Růst 1 h při 37 °C.

3. odstraňte 1 ml neindukovaného vzorku. Odstřeďujte a odstraňte supernatant. Zmrazte nebo uložte na led, dokud nebudete připraveni spustit stránku SDS.

4. přidejte IPTG na konečnou koncentraci 1 mM a růst po dobu dalších 2-3 h.

5. odeberte 1 ml indukovaného vzorku. Odstřeďujte a odstraňte supernatant. Zmrazte nebo uložte na led, dokud nebudete připraveni spustit stránku SDS.

6. Resuspendujte buněčné pelety v 200 µl SDS-PAGE vzorek pufru; teplo 3-5 min při 90 °C.

7. Analyzovat 5-10 µl pomocí SDS-PAGE následovaná Coomassie blue barvení (nebo 1-2 µl pro Western blot).

7Samples pěstuje v mini-kultur mohou být také použity pro vyhodnocení rozpustnosti konkrétního fúzního proteinu (viz Poznámka 6 pro mini-kultura projevu protocol). Na konci indukčního období sklízejte buňky centrifugací. Peletu znovu promícháme ve 200 µl studeného PBS. Lyse buňky pomocí ultrazvuku; udržujte vzorek na ledě. Uložte malý alikvot lyzátu pro analýzu pomocí stránky SDS. Odstřeďujte lyzovaný vzorek po dobu 15 minut. Odstraňte supernatant do samostatné zkumavky. Resuspendujte peletu v 200 µl PBS. Analyzujte některé surové lyzáty, supernatant, a resuspendovaná peleta pomocí SDS-PAGE nebo Western blotting. Pokud je vzorek pozorován jak ve frakci lyzátu, tak v supernatantu, je vzorek dostatečně rozpustný. Pokud je Vzorek přítomen primárně v lyzátu a resuspendované peletě, vzorek je s největší pravděpodobností v tělech okluze. V případech, kdy se protein nachází v inkluzních tělech, prozkoumejte různé podmínky exprese a přesuňte expresi na rozpustnou formu (viz Poznámka 8).

8pokud je fúzní protein exprimován primárně v inkluzních tělech (např. >80% nerozpustný), mohou být použity různé strategie ke zlepšení rozpustnosti. Často je indukce při nižší teplotě (15-25 °C) účinná při přesunu exprese z inkluzních těles na rozpustnou frakci. Buňky indukované při této nižší teplotě budou růst pomaleji a budou vyžadovat indukční období přes noc. V některých případech může být nutné použít alternativní hostitelské kmeny nebo modifikovat konstrukci plazmidu. Pokud fúzní protein zůstává primárně v inkluzních tělech i po pokusech o získání rozpustného proteinu, může být užitečné zvýšit produkci e. coli a čistí dostatek bílkovin z malého množství rozpustného proteinu, který je k dispozici. V některých případech by měly být prozkoumány další značky fúzního proteinu.

9 nízké hladiny exprese proteinu by mohly být výsledkem vzácného použití kodonu. V tomto případě může přechod na jiný kmen E. coli, který obsahuje další transkripty pro vzácnou kodonovou tRNA, významně zlepšit produkci bílkovin. Různé formulace médií nebo přidání až 2% glukózy mohou také zlepšit expresi (13, 14). Pokud existuje podezření, že exprimovaný protein je toxický pro buňky (obvykle přestanou růst po indukci IPTG), zkuste indukovat později po kratší dobu. Snížení koncentrace IPTG je další možností, kterou je třeba prozkoumat.

10monitorový růst buněk odečtením optické hustoty při 600 nm (A600). Noční kultura by měla dosáhnout A600 ~1-1, 2. Buňky by měly být indukovány v rané fázi logaritmické růstové křivky pro E. coli, A600 ~ 0,5 až 0,7. Při 37 °C bude trvat přibližně 2 hodiny, než kultury dosáhnou časného logického stádia růstu. Pokud jsou buňky pěstovány při nižší teplotě, doba inkubace musí být zvýšena, protože buňky rostou pomaleji při nižších teplotách. Obecně bude největší výtěžek fúzního proteinu dosažen, když jsou buňky indukovány při A600 = ~ 0,5. Po indukci IPTG je obecný pokyn pro inkubační dobu následující: 3 h při 37 °C, 5 h při 30 °C a přes noc při 25 °C nebo nižší. Sklizeň buněk před saturací, A600 ~ 1,0–1,2.

11aby bylo zajištěno dostatečné provzdušňování, měly by být baňky naplněny pouze na 20-30% jejich kapacity.

12je důležité, aby ve vzorku nebyly přítomny žádné inhibitory serinové proteázy před štěpením trombinem nebo faktorem Xa. Následující inhibitory proteáz musí být odstraněny před trombinu nebo faktoru Xa výstřih: AEBSF, APMSF, antitrombin III, antipain, α1-antitrypsin, aprotinin, chymostatin, hirudin, leupeptin a PMSF. Kromě toho je pefabloc TH benzamidin specifický pro trombin a Pefabloc FXa je specifický pro faktor Xa. Při předepisování proteázy je třeba se vyhnout následujícím inhibitorům proteázy: 100 mM ZnCl2, 100 µM chymostatin a 4 mM Pefabloc.

13existuje řada alternativních metod pro detekci fúzních proteinů GST. U proteinů, které dobře exprimují na vysoké úrovni, je nejjednodušší metodou sledování čištění pomocí gelů SDS-PAGE obarvených Coomassie modrou nebo stříbrnou skvrnou. Alternativou pro proteiny, které exprimují na nízkých hladinách, je použití Western blotting pomocí protilátky zaměřené buď na GST nebo na cílový protein. Alternativou pro malé výrazy je sledování přítomnosti GST pomocí testu enzymu ELISA nebo CDNB.

14Save malé množství bílkovin vzorek z každého kroku čištění, včetně lýze, supernatant, pelet, nevázané frakce od nanesení vzorku, omyjte kroky, a eluční kroky, které mají být analyzovány pomocí SDS-PAGE nebo Western blotting. Poté, co byly všechny vzorky analyzovány a sloučeny, zlikvidujte nežádoucí frakce.

15GST proteiny mohou být také čištěny metodou dávkového čištění. Metoda dávkového čištění je rychlá, snadná a vyžaduje malé vybavení; výsledný protein však může obsahovat více nečistot a má nižší výtěžek než čištění založené na chromatografii. Dávkové čištění se nejlépe využívá při podmínkách čištění screeningu. Čištění šarže popsané níže se obvykle provádí při pokojové teplotě. Aby se minimalizovalo riziko proteolytické degradace, může být postup proveden při 4 °C zvýšením inkubační doby 2 až 4krát.

1. Lyse buněk a získat rozpustný fúzní protein (viz Poznámky 8 a 21, pokud je vzorek v zařazení subjektů).

2. přidá se 2 ml 50% sypké matrice suspenze glutathion Sefarosy (1 ml objemu lože) na 100 ml supernatantu bakteriálního lyzátu. Inkubujte 30 minut při pokojové teplotě s jemným mícháním.

3. odstřeďujte 500 × g po dobu 5 minut. Odstraňte supernatant a uložte pro analýzu pomocí SDS-PAGE k určení účinnosti vazby.

4. pryskyřici omyjte 10 objemy lože PBS. Jemně promícháme a potom odstředíme 500 × g po dobu 5 minut. Odstraňte supernatant. Opakujte kroky praní a odstřeďování pro celkem 3 výplachy po 10 objemech lože.

5. fúzní protein se eluuje resuspendací pryskyřice 1,0 ml glutathionového elučního pufru na ml objemu lože. Inkubujte 10 minut při pokojové teplotě. Odstřeďujte 500 × g po dobu 5 minut. Přeneste supernatant obsahující fúzní protein do samostatné zkumavky. Opakujte eluční a sběrné kroky celkem 3krát. Supernatanty mohou být sloučeny nebo analyzovány odděleně pomocí SDS-PAGE za účelem sledování obsahu bílkovin (Viz poznámka 12).

16A objem lože se rovná jedné polovině 50% Suspenze glutathion Sefarosy 4B použité pro čištění. Pro přípravu 50% Suspenze glutathion Sefarosy (Dodává se jako ~ 75% suspenze): určete objem lože potřebný pro čisticí stupnici. Resuspendujte glutathion Sefarosu 4B. pro každý požadovaný ml objemu lože pipetujte 1,33 ml 75% suspenze do centrifugační zkumavky vhodné velikosti. Odstřeďujte při 500 × g po dobu 5 minut. Dekantujte super. Mytí s 10 objemů (10 ml na 1.33 ml původní suspenze) PBS jemným převracením zkumavky několikrát míchat, potom se odstředí 500 × g po dobu 5 min. Dekantujte super. Selhání k odstranění ethanolu řešení úložiště může interferovat s následnou závazné kroky. Přidá se 1 ml PBS na každých 1,33 ml původní suspenze. Výsledkem je 50% Suspenze.

17glutathion Sefarosa má inzerovanou minimální vazebnou kapacitu 8 mg / ml. 20 ml kolona by měla být dostatečná k čištění bílkovin z 3 × 600 ml kultur E. coli, které obsahují ~ 20-40 mg fúzního proteinu na kulturu. Jak množství použité pryskyřice, tak velikost kolony mohou být zvětšeny nahoru nebo dolů v závislosti na množství proteinu, který má být čištěn.

18odpusťte peletu za použití 25-50 µl promývacího pufru na ml původní kultury.

19porušení buněk je dokončeno, když se suspenze částečně vyčistí a změní mírně tmavší barvu. Vyvarujte se pěnění během sonikace, protože to může vést k denaturaci fúzního proteinu. Vyhněte se nadměrné osycení, protože to může vést ke společnému čištění hostitelských proteinů E. coli spolu s fúzním proteinem GST. Vysoká viskozita v důsledku uvolňování nukleových kyselin během sonikace může být snížena přidáním Dnázy nebo benzoázy do lyzačního pufru. Lysozym do koncentrace 0.2 mg / ml mohou být přidány jako pomůcka pro buněčnou lýzu. Alternativou k sonikaci je použití komerčně dostupných formulací extrakce buněk. Tyto produkty však mohou obsahovat proprietární komponenty, které interferují s následnými aplikacemi.

20If pokusy posunout vyjádření od zařazení subjektů do rozpustné frakce nepodaří, nerozpustné GST fúzní proteiny někdy může být čištěn v přítomnosti denaturačních prostředků jako je močovina, následuje znovusložení. Solubilizace pomocí detergentů, jako je sarkosyl (N-laurylsarosin), byla také úspěšně použita (15, 16). Ačkoli následující protokol byl úspěšně použit k denaturaci a re-nature GST fúzních proteinů, každý konstrukt fúzního proteinu je jedinečný a přesné denaturační a re-naturační podmínky musí být stanoveny empiricky. Mezi běžné denaturační látky, které byly úspěšně použity, patří guanidin HCl, močovina, Tween 20, CTAB a SDS (17, 18). Denaturační látky pak musí být zcela odstraněny, aby se umožnilo správné opětovné složení proteinu. Podmínky, které by měly být optimalizovány pro usnadnění opětovného skládání, zahrnují: Typ denaturantu, pH, přítomnost redukčního činidla, rychlost odstraňování denaturantu a koncentrace proteinu. Jakmile je protein znovu naturován, ověřte, že protein znovu získal svou nativní konformaci a funkci, a odstraňte nesprávně složený protein.

1. Pre-srovnat na glutathion Sepharose sloupec; ozářit do peletovaného buňkách E. coli, a oddělit lyzátu supernatant a peleta frakce odstředěním (viz 3.3 Afinitní purifikace GST fúzní protein kroky 1-8). Resuspendujte lyzátu peleta, který zahrnuje zařazení subjektů, v 15 ml promývacího pufru. Odstřeďujte 20 min při 48 000 × g (4 °C). Slijte supernatant a resuspendujte prát pelety v 12 ml U-buffer (resuspendovat ve 20 µl U-buffer na ml původní kultury). Inkubujte 2 hodiny na ledu.

2. odstřeďujte 20 min při 48 000 × g (4 °C). Supernatant, který obsahuje denaturovaný fúzní protein, přeneste do čisté odstředivkové zkumavky.

3. k supernatantu se přidá Triton X-100 na konečnou koncentraci 1%.

4. Dialyzujte vzorek na PBS / glycerol po dobu 2-3 h. Objem dialyzačního pufru by měl být minimálně 20násobek objemu vzorku.

5. Dialyzujte vzorek přes noc oproti PBS s inhibitory proteázy pomocí objemu pufru, který je >100násobek objemu vzorku.

6. Vyjměte vzorek z dialýzy a odstředivky 20 min při 4000 × g.

7. Extrahované a re-dobromyslně bílkovin ze zařazení subjektů nyní může být aplikován na glutathion Sepharose jednotlivé sloupce a čistí.

řešení:

promývací pufr: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mm PMSF, pH 8.0

U pufr: 5 M močoviny v 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-MI, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8.0

PBS/glycerol: 1X PBS, 20% glycerol, 1% Triton X-100, 5 mM, 2-ME, 5 mM EDTA, 5 mM 2 – MI, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use z peristaltické čerpadlo se doporučuje, aby se rovnoměrně kontrolu průtoku. Pokud dojde ke stlačení pryskyřice, je tlak příliš vysoký a průtok by měl být snížen.

22kinetika vazby mezi glutathionem a GST je relativně pomalá. Proto je důležité používat nízké průtoky k dosažení maximální vazebné kapacity, např. 0,1 ml / min pro 2,5 cm I. d. kolonu. Použití příliš rychlých průtoků může snížit množství vázaného fúzního proteinu v důsledku pomalé kinetiky asociace. Pro úsporu času (1,5 ml/min, respektive 0,3 ml/min) je možné provádět kroky praní a eluce rychleji. U vzorků s velkým objemem se vazba nejlépe provádí přes noc, s úpravami průtoků tak, aby kolona nebyla suchá.

23analýza nevázaných frakcí ukáže, zda je fúzní protein vázán nebo ne. Pokud protein není detekován v raných frakcích, ale objevuje se v pozdějších frakcích, znamená to, že kapacita kolony byla překročena. Snížení zátěže bílkovin nebo zvýšení velikosti sloupce zmírní tento stav.

24pokud se fúzní protein špatně váže na glutathion Sefarosu, existuje několik alternativ, jak zkusit zvýšit účinnost vazby. Vyzkoušejte mírnější metodu lýzy. Pokud je použitá metoda příliš drsná, protein se může denaturovat, a proto se nemůže vázat na kolonu. Také, pokud re-naturing protein od zařazení subjektů, ujistěte se, že všechny denaturační prostředky byly odstraněny z vyrovnávací paměti, a to buď prostřednictvím vyčerpávající dialýzu nebo aplikace vzorku na odsolování sloupec, před použitím na glutathion sloupci. Odstranění ethanolu storage řešení od glutathion Sepharose; snížit sloupec s čerstvým glutathion vyrovnávací paměti následuje mytí s PBS bezprostředně před zatěžování vzorků. Zvyšte množství pryskyřice a / nebo snižte průtok použitý pro naplnění vzorku. Zkuste do vzorku přidat 1-20 mM DTT. Pokud problém přetrvává, vyčistěte sloupec podle doporučení výrobce. Pokud vazba stále není obnovena, zkuste použít čerstvou pryskyřici.

25výnos fúzního proteinu lze také odhadnout měřením absorbance při 280 nm (A280). Koeficient extinkce pro samotnou část GST je ~ 1,5, tj. 1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml proteinu, i když koeficient extinkce pro fúzní protein bude částečně záviset na absorpčních charakteristikách cílového proteinu.

26If je problém eluci proteinů z glutathion Sepharose sloupci, zkuste se snižuje průtok a zvyšuje objem elučního pufru, který se používá. Ujistěte se, že používáte čerstvý redukovaný glutathionový pufr (udělejte to den, kdy bude použit). Zvyšte koncentraci glutathionu až na 40 mM a / nebo zvyšte pH pufru na pH 8,0-9,0. Do pufru přidejte 1-20 mM DTT (nebo jiné redukční činidlo). Přidání neiontového detergentu může také zlepšit solubilizaci a minimalizovat jakoukoli agregaci, ke které může dojít.

27kontaminace purifikovaného fúzního proteinu s proteiny hostitelských buněk E. coli je známkou toho, že sonikace byla příliš závažná. Pokud jsou přítomny degradované fragmenty fúzního proteinu, zkuste do lyzačního pufru přidat další inhibitory proteázy. Udržujte všechny vzorky, pufry a sběrné zkumavky v chladu, aby se minimalizovala proteolýza. Pokud během exprese proteinu dochází k degradaci, zkuste vzorek indukovat pozdě (~0.8 OD600) a zkrátit délku indukční periody. Může také pomoci přechod na alternativní kmen hostitele.

28alternativou k trávení v roztoku je štěpení proteázy fúzního proteinu při vazbě na matrici glutathion Sefarosy. Fusion protein je extrahován a naloženo na glutathion Sepharose následuje promytí s PBS (viz Afinitní purifikace GST fúzní protein, kroky 1-11). Spíše než eluovat protein s glutathion pufr, PBS roztok obsahující enzym je vložen do sloupce a inkubovány po dobu několika hodin při pokojové teplotě (4 °C pro PreScission proteáza). Štěpený protein se pak z kolony vymyje několika sloupcovými objemy PBS. Zbytkový fúzní protein a část GST lze z kolony odstranit promytím kolony redukovaným glutathionovým pufrem. Množství enzymu a doba inkubace musí být empiricky stanovena pro každý fúzní protein. Analyzujte všechny vzorky pomocí SDS-PAGE a určete účinnost štěpení a čistotu bílkovin.

29V dávkovém režimu štěpení proteázy přidejte empiricky stanovené množství enzymu do fúzního proteinu vázaného na pryskyřici (Viz poznámka 15 a-d). Použijte 1 ml enzymu obsahujícího PBS na ml objemu lože. Inkubujte při pokojové teplotě několik hodin s jemným mícháním. Odstřeďujte 500 × g po dobu 5 minut, aby se pryskyřice sedimentovala. Odstraňte super, který obsahuje cílový protein, do samostatné zkumavky. Promyjte glutathion Sefarosu PBS až 3krát, abyste obnovili štěpený fúzní protein. Inkubujte pryskyřici glutathionovým pufrem, abyste odstranili GST a zbytkový fúzní protein. Použijte 1 ml glutathionového pufru na ml pryskyřice. Odstřeďujte 500 × g a obnovte elutovaný GST. Opakujte až 3krát. Analyzujte vzorky pomocí stránky SDS.

30If pomocí proteázy trombinu, trávení může být prováděno v glutathion vyrovnávací paměti používané k eluovány proteiny z kolony. Pokud používáte faktor Xa, doporučuje se dialyzovat protein do Tris pufru nebo PBS pufru před trávením; glutathion přítomný v elučním pufru může narušit disulfidové můstky přítomné ve faktoru Xa, což vede k neefektivnímu trávení fúzního proteinu. Empirické stanovení podmínek trávení pro každý fúzní protein musí být stanoveno v pilotním experimentu s trávením. Vhodnou metodou je strávit 100 µg fúzního proteinu v rozmezí poměrů enzym-substrát a měnit dobu inkubace. Typický inkubační časy se pohybují v rozmezí od 2 do 8 hod. Doporučené enzym-substrát poměry pro trombin, jsou 1:100, 1:350, 1:1000, a 1:3000 (jednotky enzymu na µg fúzního proteinu) a pro faktor Xa jsou 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg enzymu na µg fúzního proteinu). V požadovaných časových bodech odstraňte 2 µg proteinu a zastavte trávení přidáním alikvotu vzorku do vařícího pufru vzorku SDS. Analyzujte vzorky pomocí stránky SDS a určete optimální podmínky štěpení. Kromě poměru enzymu k substrátu a času zvažte změnu podmínek pufru, jako je zvýšení nebo snížení koncentrace NaCl nebo přidání Ca2+ do pufru(Viz poznámka 31 Pro Tipy pro řešení problémů).

31pokud je na stránce SDS pozorováno více pásem pro cílový protein po trávení, zkontrolujte sekvenci cílového proteinu pro potenciální místa rozpoznávání sekundárních proteáz. Pokud existují sekundární štěpná místa, znovu klonujte do jiného vektoru. Pokud není pozorováno žádné štěpení, zkontrolujte sekvenci DNA a ověřte přítomnost a integritu očekávaného místa štěpení proteázy. Ujistěte se, že inhibitory proteázy byly zcela odstraněny z pufru. Přidejte více enzymů a / nebo zvyšte inkubační dobu na noc. Pokud trávení je stále neúplné na nejvyšší enzym-substrát poměry a nejdelší čas body, považují reengineering proteázy štěpící stránky zahrnují několik glycines mezi GST skupinu a cílový protein snížit pravděpodobnost stérické překážky zasahování štěpení (19, 20).

32If inhibice enzymu po štěpení je dokončeno pomocí serinové inhibitory proteáz je nežádoucí, vzorek může být aplikován na HiTrap benzamidine sloupci odstranit enzymu ze vzorku.

33If vzorku je třeba re-chromatographed na glutathion Sepharose sloupci odstranit GST a žádné nestrávené fúzní protein, je důležité, že redukovaný glutathion být zcela odstraněny ze vzorku. Glutathion vyrovná velmi pomalu přes dialyzační membrány; proto pokud dialyzační trubičky s MWCO <12,000 je použit 3 nebo více změn, vyrovnávací paměti, může být nutné k dokončení odebrání. Pro velké objemy vzorků může být vyžadována také prodloužená doba dialýzy (přes noc) a větší objem pufru.

34stejná kolona glutathion Sefarosy může být použita jak pro počáteční izolaci fúzního proteinu, tak pro opětovné čištění po enzymatickém štěpení. Doporučuje se věnovat jednu kolonu individuálnímu proteinovému konstruktu, aby se zabránilo potenciální křížové kontaminaci různých rekombinantních proteinů. Sloupce mohou být opakovaně použity vícekrát. Pokud účinnost vazby v průběhu času klesá, vyčistěte sloupec podle doporučení výrobce. Pokud není aktivita vazby obnovena, měl by být použit nový sloupec.

35maximální vazba nastane, pokud je sloupec zcela redukován; pokud však byla kolona glutathion Sefarosy promyta méně než 48 hodin před tímto krokem, může být tento krok přeskočen.

36cílový protein bude v nevázané frakci a GST a jakýkoli nerozštěpený fúzní protein se bude vázat na kolonu.

37malé objemy vzorků se doporučují pro dobré rozlišení cílového proteinu oproti jiným kontaminantům. Není-li možné koncentrovat vzorek do malého objemu, může být provedeno několik injekcí vzorku.