PMC

CPV-2 je hlavní etiologický původce virových gastroenteritid u psů. Je členem čeledi Parvoviridae, patřící do rodu protoparvovirus a druhu Protoparvovirus typu 1. To je neobaleného viru s single pletl DNA genomu, whichencodes pro dva kapsidový proteiny, VN1 a VP2, potřebné pro montáž a balení virového genomu, stejně jako pro NS1 a NS2 nenosné proteiny, whichaid v kontrole replikace DNA, montáž a regulace exprese genů .

v posledních letech vyvinula CPV-2 nové antigenní varianty. V roce 1980 byl původní kmen CPV-2 nahrazen variantou označenou jako typ 2a( CPV-2a), v roce 1984 byl identifikován CPV-2b a v roce 2001 byl detekován a hlášen CPV-2c v Itálii. Poslední varianta byla také identifikovánav Asii, Africe a Americe. Vzhledem k existenci více antigenních variant pro CPV-2 se klinické příznaky mohou značně lišit .Následně mají veterináři menší jistotu při vydávání své předběžné diagnózy a obvykle jsou vyžadovány některé laboratorní testypotvrdit jejich diagnózu; i když některé techniky byly vyvinuty v výzkumné laboratoře, jako je hemaglutinační testy, imunofluorescence, ELISA, PCR,immunochromatography test a buněčné kultury (mimo jiné), vlastně techniky s nejlepší dostupností v rámci klinických laboratoří veterinární hospitalsonly jsou immunochromatography test a PCR, však, ve výzkumu o citlivost a specifičnost těchto postupů, zprávy jsou kontroverzní.Navíc u pacientů s různým stupněm závažnosti onemocnění nebyla citlivost a specificita těchto technik rozsáhle studována.

cílem této studie je zpráva, výhody a nevýhody nabízené immunochromatography test a PCR pro diagnostiku pacientů, které představují značnou rozmanitost klinických příznaků pro CPV-2.

tato studie byla provedena podle pokynů experimentálního výzkumu zvířat Mexická oficiální norma NOM-062-ZOO-1999.

Psi s klinickými enteritida hospitalizován ve Veterinární Nemocnice pro Malá Zvířata na Universidad Autónoma de Estado de México, byly promítány pro thisstudy a vybrané na základě pozitivní nebo negativní CPV-2 pomocí nested PCR (nPCR). V důsledku toho bylo vybráno 45 psů, kteří byli pozitivně testováni, a 5 negativně testovaných psů bylo zahrnuto jako kontroly. 50 psů bylo klinicky vyšetřeno třemi veterináři současně, aby se získala citlivost klinické diagnózy. Každý veterinář vydal svou předpokládanou diagnózu diskrétním způsobem a jako diagnostický nástroj použil problémově orientovaný veterinární lékařský záznam (POVMR).

dále byly analyzovány fekální vzorky všech psů pomocí PCR a imunochromatografického testu, zatímco vzorky krve byly použity k provedení úplného krevního obrazu.

nPCR je považován za vysoce spolehlivý a citlivá technika pro identifikaci CPV-2 virových částic , a proto, v této studii, citlivost používaných testů byly korelovány s výsledky získanými dříve z nPCR, pro CPV-2diagnosis.

Pes vzorky stolice byly získány pomocí rektální výtěry, které byly pozastaveny v nuclease-free vody a 200 µl homogenáty, a byly použity forDNA extrakce. Postup byl proveden pomocí soupravy pro extrakci dna stolice QIAamp® DNA (QIAGEN, Mainz, Německo) podle pokynů výrobce. Vzorky AllDNA byly kvantifikovány pomocí spektrofotometru Q5000 Quawell (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, Usa). 100 ng DNA každého vzorkubyly použity pro PCR reakce s 50 µl konečného objemu. Dříve, pár primerů byl navržen v naší laboratoři k amplifikaci 275 bp fragment,ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) a ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA-3′) se nachází na nukleotidy 1,107–1,130 a 1,360–1,382 z VP2 genů (GenBankaccession číslo FJ0051962c).

PCR reakce byla provedena pomocí 2 µl každého primeru (200 nM), a to 12,5 µl GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI,Usa) obsahující DNA polymerázu, reakční Pufr (pH 8,5) a 400 µM každého nukleotidu (dATP, dGTP, Dctp a dTTP); 3 mM MgCl2.a 28.5 µl vody bez nukleázy. Všechny reakce byly provedeny za následujících amplifikačních podmínek; 1 cyklus 94°C po dobu 5 min autonomních komunitách denaturace, následuje 35 cyklů 94°C 30 sec, 52°C po dobu 1 min, 72°C po dobu 1 min a poslední rozšíření cyklu při teplotě 72°C po dobu 5 min.

nPCR bylo původně provedeno zesílení fragment 1,740 bp pomocí ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) a ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC-3′) primery,a byly navrženy pomocí nukleotidové sekvence 1-20 a 1,712–1,740 z genu VP2 pro psí parvovirus (GenBank přistoupení číslo FJ0051962c). Reakce bylastandardizována na konečný objem 50 µl.

reakční směs obsahovala 1 µl GoTaq® Flexi DNA Polymeráza 5 U/µl (Promega), 5 µl GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl MgCl2 25 mM, 4 µl dNTP je 200 µM, 2 µl primery, 10µl DNA s konečnou koncentraci 100 ng a 23 µl nuclease free vody. Reakce byla provedena za následujících podmínek amplifikace: 1 cyklus při 94°C po dobu 5 minut, následovalo 35 cyklů při 94°C po dobu 30 sekund, 50°C po dobu 45 sekund, 72°C po dobu 1 minuty a 1 cyklus při 72°C po dobu 5 minut. Poté byl použit 1 µl produktu této reakce jako šablona DNA pro postup hnízdění a podmínky primerů a zjemnění byly stejné pro fragment 275 bp.

Všechny amplifikační produkty byly identifikovány pomocí horizontální elektroforézy na 2% agarózovém gelu obarveny s 0,5 µg/ml ofethidium bromidem a vizualizovány pomocí UV transilluminator.

pro analýzu imunochromatografického testu na psí parvovirus (CPV Ag), anigen® kit (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) byl využit. Každá testabyla provedena podle pokynů výrobce.

vzorky krve byly odebrány z jugulární žíly pomocí vakutainerových zkumavek s EDTA jako antikoagulantem. Kompletní počet krevních buněk (CBC) byl proveden pomocí počítadla anautomatických buněk (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, Usa). Krevní filmy byly obarveny Wright-Giemsa a vyšetřeny pod fotonickýmmikroskopem. Leukopenie byla zvažována, pokud byl celkový počet CBC nižší než 6 × 103 / µl .

analýza výsledků byla provedena pomocí matice pro kódované proměnné a byly vytvořeny kontingenční tabulky pro stanovení diagnostických testovacích vlastností . Dále bylo stanoveno, že statistika Kappa odhaduje shodu mezi třemi použitými testy a nPCR. Hodnota kappa byla charakterizována podle Kantere a kolegů v 2015 whereKappa hodnota 1 označuje absolutní shodu, zatímco hodnota 0 znamená, že k dohodě dochází v důsledku náhody. Obecně platí, že hodnoty Kappa vyšší než 0,6 naznačují dobrou úroveň dohody; analýza byla provedena pomocí statistického balíčku SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, U.S. A.).

devadesát jeden bod jeden (91.1) % pozitivních psů pro CPV-2 podle nPCR bylo čistě chováno; 95. 5% pacientů bylo ve věku od dvou do osmi měsíců a 4,5% bylo starších než jeden rok. Pokud jde o jejich vakcinační stav, 40% bylo očkováno alespoň jednou, aby se zabránilo infekci CPV-2.

Četnost klinických příznaků ukázala, že tyto psy byl následující: 44.4% zobrazí zvracení a průjem; 20% měl horečku, zvracení a průjem(katarální nebo hemoragické); 17.7% ukázal jen průjem; 8.8% zobrazí pouze zvracení; a 4,4% měl průjem a horečka, a 4,4% prezentovány zvracení a horečka.Leukopenie byla pozorována u 48,8% psů (Tabulka 1).

Pomocí klinického vyšetření, veterinární lékaři diagnostikována pouze 57.8% pacientů pozitivní CPV-2 a 100% negativní psi; proto je hodnota citlivosti forclinical diagnóza byla odhadnuta jako 57.7% (CI0.95 42.2–72), a pozorované specificita byla 100% (CI0.95 46.2–98.8).

O laboratorní testy, diagnóza, z 100% psů, která vedla přes pozitivní nPCR, pouze 30/45 z těchto pacientů byli CPV-2 pozitivní throughimmunochromatography test, zatímco pět kontrolních pacientů s negativním výsledkem pro CPV-2 byla správně diagnostikována. Proto se tato technika ukázala sensitivityof 66.6% (CI0.95 50.9–79.5), a pozorované specificita byla 100% (CI0.95 46.2–98.8).

Pomocí PCR techniky, 36/45 pacienti byli pozitivní, aby CPV-2, a pět kontrolních pacientů byla potvrzena negativní celém nPCR. Tak, PCR prokázána asensitivity 80% (CI0.95 63.1–87.7) a specificita 100% (CI0.95 67.8–99.1) (Obr. 1).

shoda mezi těmito třemi technikami je prokázána pomocí hodnoty Kappa (Tabulka 2).

Gastroenteritida způsobená CPV-2 je považován za jeden z hlavních virových onemocnění, které mají vliv psů. I když klinické příznaky psí parvovirus infekce se může lišit, těch nejvíce společné příznaky byly hlášeny: anorexie, deprese, letargie, horečka ,mukoidní a hemoragický průjem a leukopenie ; v subklinických případech, některé z těchto příznaků může nebo nemusí být přítomen .

během klinického vyšetření byla pozorována variabilita klinických projevů infekce. Pouze 20% studovaných psů představovalo typické znaky jako běžnépopsané v literatuře. Klinické variabilitě tohoto onemocnění byla hlášena dříve , a někteří autoři se zabývali faktory, jako je věk, imunitní stav, cesta expozice, virové dávce, virulenci kmenů a co-infekce s infekčním agens, jako možné příčiny . To komplikuje získání přesné diagnózy CPV-2, když se veterináři spoléhají pouze na své klinické vyšetření. Proto, pokud jde o naševyšetřování pouze na základě tohoto postupu, 42,2% psů bude mít falešně negativní diagnózu CPV-2.Přes psy lékařské záznamy v této studii jsme pozorovali thatveterinarians byla vyloučena možnost infekce především, protože psi nebyli vykazuje typické klinické příznaky popsané v literatuře, byla očkována proti CPV-2 a/nebo byly dospělé. Většina psů v naší studii však vykazovala atypické znaky. Proto jsme přesvědčeni, že subklinické infectionsof CPV-2 jsou častější, a veterináři, kteří se musí rozhodnout, zda použít nebo ne další diagnostické testy s vysokou citlivostí a specifičností, shouldseriously zvážit tyto nálezy.

v této studii bylo 40% pacientů pozitivních na CVP-2 dříve imunizováno. Je dobře známo, že PCR technika je vysoce citlivá, a proto, že detectsvaccine virové částice ve výkalech od nedávno vakcinovaných pacientů; studie ukazují, že je možné získat falešně pozitivní výsledky dnech 3 10post-očkování s upravenou žít CPV vakcíny . V důsledku toho k provedení této studie byli pacienti s anamnézou očkování v předchozích 15 dnech vyloučeni. Navíc, vzorky z očkovaných psů pozitivní CPV-2 byly sekvenovány,a to ve všech studovaných případech, genovariant CPV-2c byl identifikován (data not show), což znamená, že psi byli nakaženi pole CPV-2c, s vědomím, že ne CPV-2cvaccine je zatím k dispozici v Mexiku. Navíc v Mexiku Pedroza a jeho kolegové uvedli, že nejčastější antigenní variantou u infikovaných psů byla CPV-2c .

na druhé straně mnoho veterinářů považuje přítomnost leukopenie, což je podpůrný faktor pro diagnostiku CPV-2. Zjistili jsme však, že pouze 48.8% (22/45) z studoval psů leukopenie během hodnocení, což je v souladu s dalšími zprávami, které je uvedeno přibližně 50% z psi nemají displej hematologicalterations v době hodnocení . Proto je CBC cenným nástrojem, který může poskytnout informace ozávažnost onemocnění, což naznačuje prognózu a určuje odpověď na léčbu. Leukopenie by však neměla být považována za diagnostický nástroj pro CPV-2, protože neposkytuje důkaz o přítomnosti viru.

Různé techniky virové identifikace jsou používány pro definitivní potvrzení infekce CPV-2, například rychlé testy založené na immunochromatographyare široce používán lékaři, protože postup je snadné, rychlé a dostupné. Navíc nevyžaduje přípravu vzorku nebo odeslání do specializované laboratoře k analýze. Různou citlivost tohoto testu je jeho nevýhoda; několik studií ukázaly, že jeho citlivost se pohybuje v rozmezí od 50 do 100% , a v naší studii, komparativní citlivost s nPCR bylo 66.6%. Některé studie havesuggested, že nízká technika citlivost je vzhledem k potřebě velkého množství virových částic být vrhnout do stolice psů získat positivediagnosis . Použití této techniky musí být přehodnoceno, protože se očekává vyšší pravděpodobnost falešně negativních výsledků. Aby se tomu zabránilo, je třeba použít další techniky s vyšší citlivostí .

Několik studií prokázalo, vysoká citlivost PCR-based testy; v současné době existuje více variant stejného postupu, které nabízejí sensitivitiesranges od 80 do 100% . V této studii, PCR měl 80% citlivosti, a to je pozoruhodné, nemluvě o tom, že pacienti byly pouze identifikovány pozitivní toinfection přes nPCR mezitím ani PCR ani immunochromatography testy byli schopni identifikovat.

pokud jde o hodnotu kappa, porovnali jsme výsledky mezi třemi analyzovanými metodami s nPCR. Nicméně byla prokázána špatná shoda mezi klinickou diagnózou a npcrw; byla pozorována mírná shoda mezi konvenčními PCR a nPCR, což může být způsobeno podobností mezi oběma testy.

Týkající se klinických příznaků, přítomnost buď zvracení nebo průjem byl pozorován u všech virally infikované pacienty, zatímco jiné klinické příznaky nebyly žádný relevantní pro infekce; ve shodě s klinickými příznaky a citlivost použité techniky, žádný vztah nebyl pozorován. Například, v případě, že ne.26 ukázal jen zvracení jako klinické příznaky, a to bylo považováno za negativní pro CPV-2 veterinární klinická diagnóza, nicméně, immunochromatography test, PCR a nPCRtests byly pozitivní pro CPV-2. Dále případy 41 a 42, ve kterých byl hlavním klinickým příznakem průjem, mohly být diagnostikovány pouze pozitivně na CPV-2 pomocí nPCR.

Naše data ukazují, že nejčastěji používané diagnostické testy v klinické a diagnostické veterinární laboratoře pro detekci CPV-2 jsou vysoce specifické, ale theylack citlivost, která brání přesné diagnóze pro CPV-2. V naší studii, PCR a immunochromatography test není tak citlivý jako nPCR, který byl confirmedin předchozí investigaions , nicméně, použití nPCR jako diagnóza test není ještě široký-rozšířil ve veterinárních nemocnicích,přestože je i nadále široce používán pro výzkumné účely.

Na druhou stranu, Real-Time PCR, který je také velmi citlivý, je zřídka používán, protože jeho vysoké náklady na vybavení a požadavku na vysoce specializedstaff pro jeho manipulaci. Technologický pokrok však umožnil, aby se tyto techniky staly levnějšími a jednoduššími, což by mohlo vést k jejich přímé aplikacive veterinárních nemocnicích ke zlepšení diagnostické přesnosti pro CPV-2.