Pokroky v Genové Testování-to, Co Potřebujete Vědět,

Pokroky v Genové Testování-to, Co Potřebujete Vědět,

Dr. C. H. Weaver, M. D. aktualizováno 9/1/2018

Q: Co je genomické testování?

A: genomické testování zkoumá skupinu genů a jejich různé úrovně exprese. Tato genová exprese nebo aktivita může charakterizovat, jak geny vzájemně interagují a předpovídají chování určitých tkání v těle. To je na rozdíl od genetického testování, který se dívá na konkrétní změnu v rámci jednotlivého chromozomu nebo genu, často jako součást dědičné vlastnosti.

otázka: Jakou roli hraje genomické testování v diagnostice rakoviny?
A: genomické testování může poskytnout informace o prognóze pacienta na základě genové exprese v rakovinné tkáni jedince a může často předpovědět, zda určitá terapie (jako je chemoterapie) bude přínosem.

otázka: v jakém okamžiku diagnostického procesu dochází k genomickému testování?
v: Genomické testování může nastat kdykoli po získání vzorku tkáně (biopsie nebo resekce) rakoviny.

Q. Jaké otázky bych se měl zeptat svého zdravotnického týmu ohledně genomického testování?
A: hlavní otázky, které byste měli položit svému poskytovateli zdravotní péče, jsou následující.

• je k dispozici genomické testování pro typ rakoviny, kterou mám, na pomoc při určování mé celkové prognózy?
• budou mít výsledky tohoto testování potenciál změnit vaši léčbu rakoviny? Konkrétně:
  • bude mi test schopen říci, zda určité terapie budou při mé léčbě prospěšné?
• měli jste pozitivní výsledky při používání tohoto testování u jiných pacientů?
• je toto testování pokryto mým pojistným plánem? (Tento typ testování může běžet v tisících dolarů, ačkoli mnoho plánů pokrývá testy bez výdajů z kapsy.)

otázka: existují specifické typy rakoviny, pro které je úloha genomického testování obzvláště významná?

A: Existují tři typy rakoviny pacientů, u nichž genomické testování může být zvláště výhodné:

• u Pacientů s estrogen receptor–pozitivním karcinomem prsu, které dosud nerozšířil do lymfatických uzlin (rakoviny prsu v časném stádiu) může mít prognózu, že je obtížné předpovědět pomocí biopsie tkáně sám. Předpokládané 10leté přežití), ale může také předpovědět, zda chemoterapie bude mít nějaký významný přínos, což pacientovi umožní vyhnout se toxicitě chemoterapie, pokud je to možné.
• Pacientů s určitými typy rakoviny tlustého střeva mohou také těžit z genomické testování z hlediska stanovení prognózy, predikci chemoterapie prospěch, a volba chemoterapie (určit, které chemické látky bude mít největší užitek).
• Pacienti s rakovinou, která se rozšířila do dalších míst v těle (metastazující onemocnění) nebo který má opakovaly lokálně (přes operaci a/nebo chemoterapii), může podstoupit genomické testování to vypadá, že na výraz v celé řadě genů, včetně těch, které nejsou obvykle spojeny s původním místě rakoviny. Tento typ genomického testování může identifikovat určité geny, které mohou být potenciálně cílem terapie, která nebyla původně zvažována. Změna cílené terapie by měla potenciál výrazně zlepšit přežití.

Rozvíjející Se Roli Genetiky v Diagnostice a Monitorování Rakoviny

Přehled

Rakovina je výsledkem genetických abnormalit, které ovlivňují funkce jednotlivých genů. Geny určují formu, funkci a růstové vzorce buněk. Ty, které urychlují nebo potlačují růst, se často podílejí na rakovině. Například, mnoho druhů rakoviny, mají abnormality v genu, který je zodpovědný za stimulaci buněčného růstu a/nebo gen, který normálně zabraňuje rakovině nefunguje správně. Obě tyto genetické abnormality mohou mít za následek nekontrolovaný a nadměrný buněčný růst, charakteristický rys rakoviny. Genomické testy, nebo testy, jak se nazývají vědci, jsou nástrojem pro identifikaci specifických genů v rakovině, které jsou abnormální nebo nefunguje správně. V podstatě je to jako identifikace genetického podpisu nebo otisku prstu konkrétní rakoviny.

genomické testování se liší od genetického testování. Genetické testy se obvykle používají k určení, zda má zdravý jedinec zděděnou vlastnost (Gen), která je předurčuje k rozvoji rakoviny. Genomické testy hodnotí geny ve vzorku nemocné tkáně od pacienta, u kterého již byla diagnostikována rakovina. Tímto způsobem jsou identifikovány geny, které mutovaly nebo vyvinuly abnormální funkce, kromě těch, které mohly být zděděny.

genomické testování může lékařům pomoci:

• Určit pacientovu prognózu (potenciální výsledek)
• Určit, zda je rakovina agresivní/rychle rostoucí nebo pomalu rostoucí
• Zvolit nejúčinnější léčbu pro každý jednotlivý rakoviny
• Sledovat pacienty, kteří podstupují léčbu zjistit, jestli léčba funguje
• Sledovat pacienty, kteří jsou v remisi chytit potenciální progrese onemocnění brzy, kdy je ještě léčitelné

Snad největší příslib genomické testování je jeho potenciál pro individualizaci léčby. To znamená, že pacienti s vážnější podmínky, které mohou být identifikovány a nabízeny agresivní a inovativní terapie, které mohou prodloužit jejich životy, zatímco u pacientů, kteří jsou diagnostikovány s méně závažný stav, může být ušetřen zbytečných procedur. Například některé ženy s rakovinou prsu negativní na uzliny se relapsují po léčbě samotným chirurgickým zákrokem. Genomické testování bylo prokázáno, že rozlišovat mezi které uzel-negativních pacientů s rakovinou prsu jsou více pravděpodobné, že k relapsu, a proto těžit z další chemoterapie a u pacientů, které nemusí chemoterapie.

Chcete-li ocenit, jak se věda genetiky aplikuje na diagnostiku a sledování rakoviny, je užitečné porozumět základním principům genetiky. To zahrnuje vědět, co jsou DNA, chromozomy a geny, jak fungují a jak se Informace obsažené v DNA transformují prostřednictvím genové exprese do specifických struktur, které diktují funkce buňky.

s těmito znalostmi na pozadí je možné pochopit příslib testů pro detekci genetických abnormalit, jako jsou:

• Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
• Polymerázová řetězová reakce (PCR)
• Reverzní transkripce PCR
• Microarray technologie
• Sérum proteomika

Pozadí—Základní Principy Genetiky

význam genetiky v dědičnosti, je dobře známa; nicméně, roli, že genetika hraje v kontrole struktury a funkce buněk mohou být ještě důležitější pro individuální organismus. Dědičnost zajišťuje, že lidé a všechny druhy jsou schopny reprodukovat a udržovat své jedinečné vlastnosti a režie, jak buňky jsou postaveny, co práce, kterou dělají, a jak rostou, je nezbytné, aby bylo zajištěno, že organismus přežije reprodukovat. Pochopení této kritické role, kterou DNA a geny mají při určování minutu po minutě života buňky, je také důležité pro pochopení toho, jak se genetika podílí na rakovině.

DNA: genetická informace pro celý organismus je obsažena v jádru každé buňky ve formě deoxyribonukleové kyseliny, běžně známé jako DNA. DNA je dvouvláknová spirálová (stočená) molekula. Každý řetězec se skládá ze strukturální páteře plus sekvence sloučenin obsahujících dusík zvaných dusíkaté báze, které lze považovat za abecedu genetiky. Existují čtyři báze: adenin, guanin, thymin a cytosin. Oba prameny jsou spojeny na základnách.

genetický kód nebo genetická informace, která řídí strukturu a funkci buňky, je obsažena v sekvenci bází. Základní sekvence nakonec řídí sekvenci aminokyselin, které jsou spojeny dohromady, aby vytvořily proteinovou molekulu. Různé sekvence vytvářejí různé proteiny. Proteiny, které jsou syntetizovány v buňce, určují strukturu a funkci této buňky.

chromozomy: DNA je zabalena do určitého počtu jednotek nazývaných chromozomy. Lidé mají v každé buňce 46 chromozomů. Většinu času jsou chromozomy pevně zabaleny kolem proteinů v jádru buňky, takže je nelze vidět. Ve stádiích života buňky těsně před buněčným dělením se však chromozomy stanou viditelnými světelným mikroskopem. Vypadají jako velké “ H „se čtyřmi délkami stočené DNA Spojené proteinem jako „kříž“ „H“.

geny: DNA je organizována do genů, což jsou dlouhé segmenty DNA, které zahrnují oblasti, které obsahují kódy pro proteiny zvané exony, stejně jako nekódující oblasti zvané introny. Geny jsou definovány jako základní jednotka dědičnosti, protože jsou předávány potomkům a poté replikovány a předávány jednotlivým buňkám během buněčného dělení. Replikace zahrnuje použití obou řetězců DNA jako šablon k syntéze komplementární DNA (cDNA), což je odpovídající řetězec. Výsledkem jsou dvě identické kopie DNA pro každou buňku po dokončení buněčného dělení. Za normálních podmínek zůstává struktura DNA, a tedy i geny, relativně konstantní replikací a buněčným dělením.

genová exprese: genetická informace obsažená v genech je převedena do buněčné struktury a funkce procesem zvaným genová exprese. Geny lze považovat za kódy nebo recepty pro výrobu bílkovin. Proteiny jsou základní složkou buněčné struktury a funkce. Když je gen „exprimován“, protein nebo proteiny, pro které kóduje, se aktivně budují v buňce a provádí se funkce, které tyto proteiny slouží. Například, když je her-2/neu je gen exprimován u karcinomu prsu, existuje více epidermální růstový faktor receptory (EGFRs) přítomen, což jsou proteiny na povrchu buněk, že her-2/neu kódy. Kromě toho je funkcí EGFR stimulovat buněčný růst; takže buňka, která exprimuje HER-2 / neu, má mnoho EGFRs a aktivně roste.

genová exprese probíhá prostřednictvím komplexního systému, který zahrnuje následující kroky:

• dočasné oddělení dvou řetězců molekuly DNA v určitém genu.
• Transkripce úsek DNA, což je syntéza jednovláknové kopie sekvence DNA, která je vystavena; tato kopie se nazývá messenger RNA (mRNA).
• syntéza proteinů nebo budování nových proteinů v buňce na základě informací obsažených v mRNA.

genetické abnormality: Genetické abnormality jsou změny v DNA buňky, ke kterým může dojít náhodou nebo vlivem prostředí. Tyto změny propůjčují postižené buňce určitou výhodu oproti normálním buňkám, které jim pomáhají růst. Výsledkem je, že buňka je schopna rychle rozdělit, stává růst rakoviny. Tato růstová výhoda však prospívá pouze jednotlivé buňce, a ne nutně celému organismu (člověku).

Typy genetických abnormalit zahrnují:

Přemístění—změna místa genu z jednoho chromosomu s genem na jiném chromozomu; tento typ abnormality definuje mnoho různých leukémií

Delece—genu nebo sekvence nukleotidů chybí v DNA

Polymorfismy—variace v nukleotidové sekvenci

Testy pro Detekci Genetických Abnormalit

různé nové laboratorní testy mohou odhalit genetické abnormality. Nalezení nemoc způsobující mutace v genu může potvrdit podezření na diagnózu rakoviny nebo identifikovat ty náchylní k určitým typům nádorů. Některé z těchto technik, které se v současné době používají v klinickém prostředí, zahrnují:

• Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
• Polymerázová řetězová reakce (PCR)
• Reverzní transkripce PCR

Kromě toho, následující laboratorní techniky jsou používány ve výzkumu rakoviny a mohou být k dispozici pro klinické použití v budoucnu:

• Microarray

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)

RYB je laboratorní technika, která se používá k detekci genetických abnormalit v single-cell a single-gene úrovni, jako jsou numerické abnormality (zisky a ztráty z nukleotidů), a přemístění (změna místa genu nebo segmentu genů na jednom chromosomu s genem nebo segmentu na jiný chromozom). Tyto abnormality hrají roli ve vývoji a progresi některých rakovin, jako jsou leukémie a lymfomy1.

jak ryby fungují? Ryby se provádějí na vzorkových buňkách, jejichž DNA se rozpadla tak, aby byly viditelné jednotlivé chromozomy. K tomu dochází během buněčných fází těsně před buněčným dělením, nazývaným metafáze nebo mezifáze. Dna vzorku se nejprve denaturuje za použití tepla a chemického formamidu, takže se jednotlivé řetězce oddělí a odhalí základní sekvenci. Dále jsou specifické sekvence DNA, nazývané sondy, které jsou připojeny k barevnému fluoru, inkubovány nebo kombinovány se vzorkovou DNA. Sondy křížit (připojení) s DNA v chromozomech, které je doplňkem k základní sekvence sondy. Přítomnost nebo nepřítomnost fluorescence z hybridizované DNA a sondy jsou viditelné specializovaným mikroskopem a ukazují, zda je ve vzorku přítomna zajímavá sekvence DNA. Kromě toho lze k detekci translokací, inverzí a amplifikací, které se podílejí na rakovině, použít specializované rybí techniky.2

RYBY v prsu a rakoviny vaječníků: běžné použití pokud se RYBY je zjistit, zda pacienti s karcinomem prsu a rakoviny vaječníků overexpress HER2/neu onkogenu, gen, který je běžně zapojen do rakoviny. HER2 / neu nese genetický kód pro receptor HER2, protein na povrchu některých rakovinných buněk. HER2 se váže s růstovými faktory v krvi, čímž stimuluje růst rakovinných buněk.

HER2 / neu je amplifikován přibližně u 20% až 30% karcinomů prsu a vaječníků a tato amplifikace a / nebo nadměrná exprese naznačuje špatnou prognózu.3 ryby lze použít ke sledování, zda onkogen HER2 / neu vysílá více signálů na úrovni jednotlivých buněk, což naznačuje amplifikaci genu.

ryby v hematologických (krevních) rakovinách: Ryby mohou být také použity k diagnostice a léčbě různých hematologických malignit. Genetická abnormalita, která je základem mnoha hematologických malignit, je chromozomální translokace nebo měnící se místa genu z jednoho chromozomu s genem na jiném chromozomu.

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

PCR je in vitro laboratorní metody, která je vhodná pro genetické testování pro prevenci a detekci minimální reziduální nemoci, což je malé množství onemocnění vlevo po léčbě, která může vést k recidivy a není obvykle zjistitelné s jinými technikami. Tento postup zesiluje segment DNA z malého vzorku, což je zjistitelné. S PCR mohou být relativně malé sekvence známé DNA replikovány do milionů kopií za krátkou dobu.

jak PCR funguje? Tato metoda vyžaduje zásadě čtyři komponenty: 1) vzorek DNA, 2) dostatečný přísun nukleotidů, 3) teplo-stabilní polymeráza je enzym, který je zodpovědný za kopírování DNA, a 4) primery, krátké sekvence nukleotidů, které leží na obou stranách DNA fragment zájem a signál polymerázové pro zahájení replikace konkrétního segmentu DNA.

PCR je třístupňový proces, každý se vyskytuje při jiné teplotě. Vzorek DNA se nejprve zahřeje na přibližně 90 ° C, aby se oddělily 2 spárované řetězce DNA. Jakmile se oddělí, to se ochladí na teplotu, která umožňuje hybridizaci primerů k jejich komplementární sekvence na cílové DNA, cca 40ºC. Nakonec k replikaci DNA dochází při přibližně 70 ° C, což je teplota, při které je DNA polymeráza nejaktivnější. Tento proces se opakuje 20 až 30krát, což má za následek přibližně 1 milionkrát amplifikaci sledovaného fragmentu DNA.4

reverzní transkripce PCR

reverzní transkripce (RT) – PCR je technika, která detekuje, do jaké míry jsou geny exprimovány. Složité procesy řízení, které segment DNA odděluje, dostane přepsán (zkopírován) do mRNA, a pak vyjádřena jako proteiny v buňce. Ne všechny geny jsou transkribovány a pak vyjádřeny stejně. Vzhledem k mnoho ovládacích prvků v buňce, některé geny jsou vyjádřeny, což znamená, že jsou přepisována a vyjádřil ve vyšší míře, než je obvyklé, zatímco ostatní geny jsou nyní vyjádřil, nebo „vypnout“ tak, že některé funkce nejsou projevuje v buňce.

jak RT-PCR funguje? RT-PCR používá stejné kroky jako PCR k amplifikaci segmentu DNA, ale vzorek je bezplatnou kopií mRNA. Počínaje mRNA měří tento test pouze DNA, která je exprimována, což umožňuje určit míru exprimování určitých genů. Nedávné použití RT-PCR v klinické onkologii zahrnuje detekci mikrometastáz lymfatických uzlin u rakoviny prostaty a kostních metastáz u rakoviny prsu.5

RT-PCR u karcinomu prsu: Test rakoviny prsu Oncotype DX™ využívá RT-PCR ke stanovení individuálního rizika recidivy u žen s karcinomem prsu pozitivním na estrogenový receptor (ER). Tento test hodnotí expresi 21 genů u rakoviny prsu. Nadměrná exprese některých z těchto genů naznačuje horší prognózu, zatímco exprese jiných může naznačovat lepší prognózu. Exprese všech 21 genů se používá k výpočtu „Recurrence Score™“ nebo pravděpodobnosti, že se tato rakovina bude opakovat. Velké klinické studie ukázaly, že Skóre Recidivy™ je účinnější pro predikci prognózu žen s node-negativní, ER-pozitivní rakoviny prsu než standardní opatření, jako je věk pacienta, rakovina velikosti a stadiu rakoviny.6

Strategie pro Zlepšení Detekce Genetické Abnormality

Několik metod pro detekci genetických abnormalit jsou využívány pro výzkum rakoviny. I když se dosud běžně nepoužívají v klinickém prostředí, následující se zdají být slibné a mohou být v budoucnu použity pro diagnostiku, testování a sledování rakoviny.

Microarrays: Microarray analýza je technika, která kombinuje biologii s informatikou generovat genetický profil pro daný vzorek tkáně, který odráží aktivitu tisíců genů. Tato technologie má výhody oproti FISH nebo PCR, protože v jediné analýze může vyhodnotit expresi všech genů, které mohou být zapojeny do rakoviny, spíše než jen několik. Graficky ukazuje, jak jsou všechny geny zapojeny do rakoviny, microarrays může generovat „genetický podpis“ pro konkrétní rakovinu. Díky tomu je identifikace podtypu rakoviny přesnější. Schopnost pořídit snímek genetického podpisu rakoviny může vést k lepšímu pochopení toho, jak se tato rakovina vyvíjí a jak navrhnout individualizovanou léčbu.

jak microarrays práce? Zatímco se používají různé metody microarray, každý se skládá z pěti základních kroků:

• Příprava vzorku
• Kombinace vzorku s počítačový čip,
• Skenování počítačový čip,
• Normalizace
• Počítačové analýzy výsledků.

Příprava vzorku: V počáteční krok, cDNA je syntetizován od RNA do reverzní transkripce (nezapomeňte transkripce zahrnuje kopírování DNA, aby se RNA, tak reverzní transkripce je generování DNA od RNA) z RNA byla extrahována z obou testovací a referenční vzorek. Segmenty DNA vzorku jsou označeny fluorochromy nebo radioaktivními chemikáliemi, takže je lze detekovat po kombinaci s počítačovým čipem.

kombinace vzorku s počítačovým čipem: dále je vzorek kombinován s počítačovým čipem, což je obdélníková mřížka skvrn. Každé místo má mnoho kopií určité sekvence DNA. Tyto sekvence jsou odvozeny z veřejné databáze DNA sekvencí, které byly získány prostřednictvím Projektu Lidského Genomu, vědeckého úsilí, který identifikoval prakticky všechny sekvence DNA v lidských druzích.

když je vzorek přidán do počítačového čipu, dojde k procesu zvanému hybridizace. To znamená, že segment dna vzorku se váže (hybridizuje) na segment na počítačovém čipu, který má přesnou komplementární sekvenci nukleotidů(čtyři sloučeniny, které jsou abecedou genetiky).

skenování počítačového čipu: jakmile je hybridizace dokončena, skenery se používají k detekci fluorescence a vytvoření digitálního obrazu, který odráží, kde je vzorek DNA kombinován se skvrnami na čipu microarray.

normalizace: Protože intenzita surového signálu se může lišit mezi jednotlivými čipy od mnoha pacientů nebo experimentů, musí být individuální intenzita čipu přizpůsobena společnému standardu nebo normalizována. Například odčítání šumu pozadí je běžná normalizační metoda, která se aplikuje na všechny vzorky. Normalizace umožňuje porovnat profily genové exprese od mnoha pacientů nebo experimentů.

počítačová analýza: posledním krokem experimentu microarray je počítačová analýza. Tisíce surových datových bodů, které vyplývají z analýz microarray, jsou v podstatě nesrozumitelné, pokud nejsou vyhodnoceny v kontextu jiných výsledků. Například, profilu genové exprese (microarrays výsledky) normální a nemocné tkáni může být ve srovnání identifikovat geny, které se liší v jejich projevu a také určit vzor (profil), které mohou naznačovat odlišné třídy nebo fázi onemocnění.7

Microarrays v onkologii: Analýza Microarray přispěla k onkologii zvýšením porozumění genetickému základu několika typů rakoviny, včetně non-Hodgkinova lymfomu B-buněk (BCNHL), akutní leukémie a rakoviny prsu.

• značné znalosti týkající se patologie BCNHL byly získány porovnáním vzorců genové exprese nemocné a normální tkáně. Dvě různé kategorie onemocnění vykazují odlišné profily genové exprese. Microarrays pomohly vytvořit tyto profily exprese a, v budoucnu, mohou pomoci přesně klasifikovat nové případy BCNHL.
• V případě akutní leukémie, microarrays pomohly stanovit odlišné genové exprese vzory, které pomohly odlišit akutní lymfocytární leukémie (ALL) a akutní myeloidní leukémie (AML). Pomocí těchto profilů bylo správně předpovězeno 29 z 34 nových případů leukémie.
• Kromě toho, microarrays pomohly identifikovat dva odlišné profily genové exprese u karcinomu prsu, BCRA1 a BCRA2. Toto zjištění naznačuje různé způsoby vývoje rakoviny prsu a poskytuje stopy, které podporují další pochopení příčiny rakoviny prsu.7

1 Spagnolo SD, Ellis DW, Juneja S, Leong AS, et al. Úloha molekulárních studií v diagnostice lymfomu: přehled. Patologie 2004; 36 (1) 19-44.

2 Spurbeck JL, Adams SA, Stupca PJ, Dewald GW. Primer na Lékařské genomiky část XI: vizualizace lidských chromozomů. Mayo Clinic Proceedings 2004: 79: 58-75.

3 Paik S, Hazan R, Fisher ER, et al. Patologické nálezy z Národního chirurgického adjuvantního projektu prsu a střev: prognostický význam nadměrné exprese proteinu erb B-2 u primárního karcinomu prsu. J Clin Oncol 1990; 8: 103-112.

4 Tefferi A, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer na Lékařské genomiky Část II: Základní principy a metody v molekulární genetice. Mayo Clinic Proceedings 2002; 77: 785-808.

5 Tefferi A, Wieben ED, Dewald GW, et al. Primer na Lékařské genomiky Část II: Základní principy a metody v molekulární genetice. Mayo Clinic Proceedings 2002; 77: 785-808.

6 Paik S, Shak S, Tang G, et al. Multigenový PT-PCR test pro predikci recidivy u pacientů s negativním karcinomem prsu-NSABP studie B-20 A B-14. Proc 26. ročníku San Antonio Breast Cancer Symposium. Prosinec 3-8k, 2003; San Antonio, TX, Abstraktní #16.

7 Tefferi A, Bolander ME, Ansell SM, et al. Primer na Lékařské genomiky Část III: Microarray experimenty a analýza dat. Mayo Clinic Pokračování2002; 77: 927-940.