Protein purificationEdit
Polyhistidine-tagy jsou často používány pro afinitní purifikaci polyhistidine-tagged rekombinantních proteinů exprimovaných v Escherichia coli a jiné prokaryotické expresní systémy. Bakteriální buňky jsou sklizeny prostřednictvím odstředění a výsledné buněčné pelety roztrhli buď fyzikálním způsobem nebo prostředky, detergenty a enzymy jako je lysozym nebo jakoukoli kombinaci těchto. V této fázi obsahuje surový lyzát rekombinantní protein mezi mnoha dalšími proteiny pocházejícími z bakteriálního hostitele. Tato směs se inkubuje s afinitní pryskyřicí obsahující vázané dvojmocné ionty niklu nebo kobaltu, které jsou komerčně dostupné v různých odrůdách. Nikl a kobalt mají podobné vlastnosti a protože jsou sousedními přechodnými kovy periody 4 (v. Železná triáda). Tyto pryskyřice jsou obecně sepharose/agarózového funkcionalizovaných s chelatační látka, jako iminodiacetic kyseliny (Ni-IDA) a nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) pro nikl a karboxyl-metyl aspartát (Co-CMA) pro kobalt, které polyhistidine-tag váže s mikromolárních afinitu. Ernst Hochuli et al. spojený 1987 NTA ligand a nikl-ionty na agarózové korálky. Pryskyřice se pak promyje fosfátovým pufrem, aby se odstranily proteiny, které specificky nereagují s iontem kobaltu nebo niklu. U metod založených na Ni lze účinnost praní zlepšit přidáním 20 mM imidazolu (proteiny se obvykle eluují 150-300 mM imidazolem). Obecně mají pryskyřice na bázi niklu vyšší vazebnou kapacitu, zatímco pryskyřice na bázi kobaltu nabízejí nejvyšší čistotu. Čistotu a množství bílkovin lze posoudit pomocí SDS-PAGE a Western blotting.
afinitní purifikace pomocí polyhistidinové značky obvykle vede k relativně čistému proteinu, pokud je rekombinantní protein exprimován v prokaryotických organismech. V závislosti na navazujících aplikací, včetně čištění proteinových komplexů pro studium proteinových interakcí, čištění od vyšších organismů, jako jsou kvasinky nebo jiných eukaryot může vyžadovat tandemové afinitní purifikace pomocí dvou značek, aby výnos vyšší čistoty. Alternativně, jeden-krok čištění pomocí imobilizované ionty kobaltu, spíše než niklové ionty obecně přináší podstatné zvýšení čistoty a vyžaduje nižší koncentrací imidazolu pro eluci z jeho tagged bílkovin.
Polyhistidine značkování je možnost volby pro čištění rekombinantních proteinů v denaturaci podmínek, protože jeho působení je závislé pouze na primární strukturu bílkovin. Například, i když rekombinantní protein násilně exprimován v e. coli produkuje inkluzní těleso a nelze jej získat jako rozpustný protein, může být čištěn denaturací močovinou nebo hydrochloridem guanidinu. Obecně platí, že pro tento druh techniky, histidin vazba je titrace pH namísto imidazolu závazné—na vysoké pH, histidin se váže na nikl nebo kobalt, ale při nízkém pH (~6 pro kobalt a ~4 pro nikl), histidin stává protonované a soutěžili mimo kovových iontů. Porovnejte to s purifikací protilátek a purifikací GST, což je předpokladem správného (nativního) skládání zúčastněných proteinů. Na druhou stranu se říká, že značka His má tendenci agregovat a insolubilizovat více než jiné značky afinity.
sloupce Polyhistidin-tag si uchovávají několik dobře známých proteinů jako nečistoty. Jedním z nich je peptidyl prolyl isomeráza typu FKBP, která se objevuje kolem 25kDa (SlyD). Nečistoty jsou obvykle odstraněny pomocí sekundární chromatografické techniky, nebo vyjádřením rekombinantní protein v SlyD-nedostatečné kmene E. coli. Alternativně, ve srovnání s pryskyřicemi na bázi niklu, mají kobaltové pryskyřice menší afinitu s SlyD z E. coli, ale v několika případech je to mírně užitečné.
Proteiny s různými počty polyhistidine kategorie eluovat jinak z nikl-affinity resin. U proteinů s jednou značkou hexahistidinu umožňuje imidazol 75 mM eluci z Ni-NTA, zatímco u proteinů se dvěma značkami hexahistidinu je pro eluci vyžadován imidazol 100 mM. Tento krok-moudrý eluce může být použit k izolaci specifických proteinů sestavy ze směsi, tak jak je definován heteromultimers (např. AB heterodimeru ze směsi včetně AA a BB homodimers, pokud pouze podjednotka B má polyhistidine tag). Takový přístup byl použit v izolaci monovalentního streptavidinu.
vazebné testyedit
Polyhistidin-tagging lze použít k detekci interakcí protein-protein stejným způsobem jako pull-down test. Tato technika je však obecně považována za méně citlivou a také omezena některými jemnějšími aspekty této techniky. Nelze například použít redukční podmínky, nelze použít EDTA a mnoho typů detergentů. Nedávné pokroky v duální polarizace interferometrie je přístupný EDTA a širší použití činidel, a použití takových site-specific tagy výrazně zjednodušuje přímé měření spojené konformační změny.
fluorescenční značkyedit
Hexahistadine CyDye tagy byly také vyvinuty. Ty používají niklovou kovalentní koordinaci ke skupinám EDTA připojeným k fluoroforům za účelem vytvoření barviv, která se připojují k polyhistidinové značce. Ukázalo se, že tato technika je účinná při následující migraci bílkovin a obchodování s nimi. Došlo také k nedávným objevům, které ukazují, že tato technika může být účinná pro měření vzdálenosti pomocí přenosu fluorescenční rezonanční energie.
Fluorohistidinové značkyedit
byla hlášena značka polyfluorhistidinu pro použití v translačních systémech in vitro. V tomto systému se používá rozšířený genetický kód, ve kterém je histidin nahrazen 4-fluorohistidinem. Fluorovaný analog je začleněn do peptidů uvolněnou substrátovou specificitou histidin-tRNA ligázy a snižuje celkovou pKa tagu. To umožňuje pro selektivní obohacení polyfluorohistidine označené peptidy v přítomnosti komplexních směsí tradičních polyhistidine kategorie změnou pH promývací pufry.
