Srovnání mezi Konvenční Odvápnění a Mikrovlnná trouba Asistovaná Metoda v Kostní Tkáni Postižené s Mycetom

Abstrakt

Mycetom je celoživotní granulomatózní onemocnění podkožní tkáně a kosti. Histopatologie je podložená indikativní metoda založená na předpokladu definitivní diagnózy mycetomu. Vyžaduje efektivní zpracování tkání včetně odvápnění kostí. Proces odvápnění musí zajistit úplné odstranění vápníku a také správné zachování barvicí schopnosti tkání a mikroorganismů. Cíla. Porovnat konvenční metodu používanou při odvápňování s mikrovlnnou metodou za použití různých odvápňovacích roztoků. Byly testovány různé vlastnosti, včetně rychlosti odvápnění a morfologické a houbové konzervace v kostní tkáni postižené mycetomem. Materiály a metody. Tři odvápnění řešení byly použity k odstranění vápníku z 50 kostní vzorky tkáně postižené s mycetom, včetně 10% neutrální pufrovaný EDTA (pH 7.4), 5% kyselina dusičná, 5% kyselina chlorovodíková. Byly použity konvenční a mikrovlnné metody. K vyhodnocení morfologií kostí a hub byly použity skvrny hematoxylin-eosin (HE), gridleyova skvrna a Grocott hexamin-silver. Test. Na odvápnění době konvenční metodou ve srovnání s troubou metoda s 10% EDTA (pH 7.4) se 120 hodin a 29 hodin, zatímco 5% kyseliny chlorovodíkové a 5% kyseliny dusičné trvalo 8 hodin a 3 hodiny, samostatně. Také 10% EDTA je nejlepším odvápňovacím činidlem pro barvení a plísňové skvrny. Pro barvení houbami lze použít 5% kyseliny chlorovodíkové a 5% kyseliny dusičné. Uzavření. Současná studie zkoumala účinky různých odvápňuje agenti, stejně jako dva odvápnění postupy na zachování struktury kostí a plísňové skvrny, které pomohou rozvíjet vhodné protokoly pro analýzy kostní tkáně postižené s mycetom infekce.

1. Úvod

Mycetom je celoživotní granulomatózní, postupně zhoubné epidemie onemocnění kůže a podkožních tkání, které mohou postoupit do hlubší struktury, jako jsou svaly a kosti a vést k rozsáhlé destrukci, hlavně nohou, vyžadující široké lokální chirurgická excize nebo amputace končetiny . Mycetom je definován triumvirátem expanze, vyčerpávající dutiny, a existence koloniálních zrn v zánětlivých exsudátech . Infekce je klasifikována jako eumycetom (houbová infekce) nebo aktinomycetom (bakteriální infekce) . Je to obecně stav tropických a semitropických oblastí, nápadně Súdán . Zrna plodin Madurella mycetomatis jsou obrovská, v rozmezí od 0,5 do 3 mm a vypadají zaoblené, oválné nebo trilobed. Skládají se z křížové hyfy zakořeněné v intersticiálním hnědém cementu, skládající se z melaninu podobného černohnědého pigmentu . Histopatologické vyšetření je rychlá orientační metoda, stejně jako výhodné procesu na předpokladu konečné diagnózy mycetom onemocnění a obsahuje zprávu, která popisuje morfologické prezentace původci. Příčinný činitel může být stále izolován z postižené kostní tkáně . Odvápnění je základní krok, který je běžně dosaženo pro histopatologické vyšetření kostí . Minerály v kostech se skládají z vápníku a fosforu a nerozpustné soli obsahují více než šedesát procent kostní tkáně . Tyto minerály poskytují tvrdost kostí a jsou příčinou obtíží při řezání tkáně pomocí rotačních mikrotomů . Tyto tkáně musí být zpracována tak, aby extrakt, fosforečnan vápenatý je postup, známý jako odvápnění, prostřednictvím tvorby tkáně dostatečně jemný, aby být řez do mikrotom. Odvápnění se provádí kyselinami, které tvoří rozpustné vápenaté soli nebo chelatační činidla, která se váží na ionty vápníku. Současné konvenční metody odvápňování jsou charakterizovány pracnými procesy a přetrvávajícím selháním barvicí reakce tkání . Při konvenčním způsobu odvápnění se kostní tkáně umístí do odvápňovací tekutiny při pokojové teplotě se změnami roztoku v pravidelných intervalech až do dosažení koncového bodu. Mikrovlnná odvápnění je inovativní technika ve srovnání s konvenční metodou . V tomto procesu se pevné tkáně umístí do odvápňovacího roztoku v mikrovlnné troubě pro periodické trvání s obvyklými posuny odvápňovacích tekutin až do dosažení koncového bodu. Mikrovlnné záření bylo provedeno k urychlení postupu odvápnění přibližně ze dnů na hodiny . Cílem této studie bylo porovnat konvenční metodu používanou při odvápňování s modifikovanou mikrovlnnou metodou s použitím různých odvápňovacích roztoků. Byly testovány různé vlastnosti, včetně rychlosti odvápnění a morfologické a houbové konzervace v kostní tkáni postižené infekcí Madurella mycetomatis.

2. Materiály a Metody

Toto je experimentální popisné studie bylo porovnat konvenční odvápňuje postup s mikrovlnná trouba-zvýšená odvápnění s ohledem na tkáně, morfologie ovlivněna mycetom infekce pomocí hematoxylin a eosin, Gridley, a Grocott hexamin-stříbrné skvrny na kompletní identifikaci Madurella mycetomatis příčinné organismy. Tato studie byla provedena ve Výzkumném centru Mycetoma ve Fakultní nemocnici Soba a na fakultě lékařské laboratorní vědy University of Al Neelain. Písemný informovaný souhlas byl získán od všech pacientů. Bylo odebráno padesát amputovaných končetin postižených mycetomem. Kostní biopsie byly rozřezány pomocí vhodné pily na kousky o tloušťce 5 mm a poté fixovány v 10% formálním fyziologickém roztoku po dobu 48 hodin. Byly promyty pod tekoucí vodou po dobu 30 minut, aby se odstranil fixační prostředek.

2.1. Konvenční Postup Odvápnění

Tři kusy 5 mm silné oddíly z kostní biopsie byly ponořené ve třech 250 ml Pyrex Squat Kádinek, každá obsahující 100 ml 5% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (HCl), 5% vodného roztoku kyseliny dusičné (HNO3) a 10% kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA), umístěné na pokojovou teplotu (v průměru 28°C), viz Tabulka 1. Koncový bod odvápnění byl zkontrolován metodou oxalátu vápenatého u dvou kyselých odvápňovačů (5% HNO3 a 5% HCl) po dvouhodinovém intervalu následovně: 5 ml používá odvápňuje tekutin byl převezen a umístěn do zkumavky, pak lakmusový papír byl přidán, a amoniaku, hydroxidu sodného byl přidán po kapkách, až lakmusový papírek změnil, což znamená alkalické pH odvápňuje tekutiny bylo jasné. 5 ml nasyceného roztoku šťavelanu amonného bylo přidáno, když odvápňuje roztok zakalí, což ukazuje na přítomnost vápníku do kostní tkáně tak, že odvápňuje řešení bylo nahrazeno novým řešením, a proces se opakuje každých 30 minut až do dokončení odvápnění proces. Pro EDTA bylo použito fyzikální testování odvápňovače, při kterém byl proces odvápnění považován za ukončený, když byla kost snadno proniknuta jehlou. Průměrná celková doba odvápnění byla 7 hodin a 30 minut, 8 hodin a 120 hodin pro 5% kyselinu dusičnou, 5% HCl a 10% EDTA.

2.2. Mikrovlnná Trouba Postup

dům mikrovlnná trouba trouba (Mikrovlnná trouba Midea 20L, 700W, Digitální, EM720CFF) s nemovitou otočný talíř byl použit. Skleněná kádinka obsahující 100 ml destilované vody byla předehřátá po dobu 5 sekund, aby se magnetron zahřál. To bylo nahrazeno 100 ml čerstvé destilované vody a ozářeno, aby se udržela teplota kolem 41-43°C. to trvalo 15 sekund. Skleněné kádince bylo přiděleno na různých místech v troubě při ozařování je pro řešení nejlepší umístění vzorku během mikrovlnná trouba odvápnění od mikrovlnné trouby použil konstantní načasování ale není konstantní teplotu. Tři kusy sekcí kostí o tloušťce 5 mm byly ponořeny do 250 ml kádinek Pyrex Squat obsahujících 100 ml 5% vodné kyseliny chlorovodíkové (HCl), 5% vodné kyseliny dusičné (HNO3) a 10% EDTA. Pak byly převedeny do mikrovlnné trouby, a vzorky byly ozářeny na deset cyklů deset sekund (v 15-minutových intervalech) pro celkovou dobu 2-4 hodin pro kyselinu decalcifiers (5% HNO3 a 5% HCl). Teplota odvápňuje roztoku byla udržována na kolem 41-43°C. odvápňuje řešení a koncový bod odvápnění byly kontrolovány, a odvápňuje řešení byla opakovaně změněna, dokud dokončení odvápnění. Koncový bod odvápnění byl zkontrolován pomocí oxalátu vápenatého a fyzikálních testů, jak bylo uvedeno výše. Průměrné celkové odvápněné časy byly 3 hodiny a 45 minut, 5 hodin a 30 minut a 29 hodin a 4 minuty pro 5% kyselinu dusičnou, 5% HCl a 10% EDTA. Po úplném odvápnění byly tkáně promyty destilovanou vodou a přeneseny do 0,3% roztoku amoniaku po dobu 5 minut, aby se neutralizovala použitá kyselina.

2.3. Zpracování tkání a Barvení

vzorky byly podrobeny automatické zpracování tkání pomocí následujících protokolů: kostní biopsie byly umístěny v 10% formální fyziologického roztoku po dobu jedné hodiny. Poté, 50% alkoholu jedna hodina, 70% alkoholu jedna hodina, 90% alkoholu jedna hodina, poté 100% alkoholu tři změny každé dvě hodiny, xylen dvě změny, každý pro jeden a půl hodiny, konečně parafín dvě změny každé dvě hodiny. Tkáně byly vloženy do parafinových bloků a byly pomocí rotačního mikrotomu rozřezány na tloušťku 5-6 µm. Řezy byly barveny Mayer ‚ s hematoxylin, jak to popsal Mayer v roce 1903, a counterstain v každém byl 1% eosin (HE) . Gridleyova skvrna byla použita pro demonstraci hub, jak popsal Gridley v roce 1953); po deparafinizaci a rehydrataci byly tkáňové řezy umístěny do 2% kyseliny chromové po dobu 30 minut. Poté byly dobře promyty vodou z vodovodu, opláchnuty destilovanou vodou a poté umístěny do schiffova činidla po dobu 20 minut. Poté byly promyty v tekoucí vodě z vodovodu po dobu 10 minut a opláchnuty 70% ethanolem a poté 95% ethanolem. Po dobu jedné minuty byly kontrastovány Metanilovou žlutou barvou a dobře opláchnuty destilovanou vodou. Poté byly dehydratovány v xylenu a namontovány v distyrenu, změkčovadle a xylenu (DPX). Poté byly řezy zkoumány pod mikroskopem . Také, Grocott hexamin-stříbrná metoda pro houby, jak to popsal Grocott v roce 1955 byl používán v které části byly oxidovány s 4% vodný kyselina chromová pro jednu hodinu, promyje ve vodě po dobu několika sekund, smísí s 1% disiřičitanu sodného po dobu jedné minuty, prát v tekoucí vodou po dobu 3 minut, důkladně opláchnout v destilované vodě, umístěné v předehřáté pracovní stříbrný roztok se ve vodní lázni při 60°C po dobu 20 minut, opláchnout no v destilované vodě, promyje tekoucí vodou po dobu 5 minut, kontrastním pracovní světlo zelené za 15 sekund, dehydratované a zrušeno v xylenu a montáž v DPX, a nakonec zkoumány pod mikroskopem.

2.4. Vyhodnocení výsledků

sekce byly hodnoceny odborným histopatologem. Kvalita odvápnění postup a výsledek barvení byly také posuzovány a hodnoceny pravidlo, a kvalita odvápnění byla hodnocena podle následujících kritérií: doba odvápnění, morfologické zachování tkáňové morfologie a Madurella mycetomatis houby tím, ŽE; Gridley a Grocott methenamin-stříbro barvení byla odstupňována od 1 do 4 (1: špatná, 2: fair, 3: dobré a 4: vynikající) .

2.5. Statistická analýza

analýza dat byla provedena pomocí programu SPSS. Jednosměrná ANOVA byla použita k prokázání účinku tří odvápňovacích roztoků na kvantitativní analýzu kvality řezu a uchování hub. V Kruskal–wallisova testu byla provedena k určení, zda existuje významný rozdíl mezi řešeními testovány pro každý z parametrů vyhodnoceny spolu s dvěma experimenty. Rozdíly s byly interpretovány jako statisticky významné.

3. Výsledky

do studie bylo zahrnuto padesát případů Madurella mycetomatis s černým zrnem. Nohy byly nejvíce postižené anatomické oblasti, ve 48 případech (96%) a ve dvou případech (4.0%) v ruce. S ohledem na čas odvápnění v různé experimenty, mezi tři řešení testováno, odvápnění s 10% EDTA (pH 7.4) vzal nejdelší čas pro konvenční metodou (až 120 hodin ve srovnání s 29 hodin s troubou), a použití kyseliny-odvápňuje řešení trvalo co nejkratší době od 8 hodin do 3 hodin pro různé odvápnění metody. Kvalita tkáně morfologie různých typů odvápňuje řešení pomocí odvápnění mikrovlnná trouba metody ve srovnání s konvenční metodou s Mayer ‚ s hematoxylin a eosin barvení s ohledem na jaderné a cytoplazmatické vzhled dosaženo různých výsledků. Také, 10% EDTA-odvápňuje kosti vypadaly, že mají významně lepší výsledek (P hodnota pomocí chi-kvadrát testu: materiálu 0,023) ve srovnání s 5% HNO3 a 5% HCl. Výborná zpráva o barvení byla 43 (86%) versus 32 (64%), 42 (84%) oproti 18 (36%), respektive 33 (66%) oproti 1 (2%). Na Grocott methenamin-stříbro skvrna metoda byla použita pro demonstraci Madurella mycetomatis původce týkající se morfologie a jas hub a tkáňových řezů odvápňuje o 10% EDTA, 5% HNO3 a 5% HCl pomocí konvenční a mikrovlnné metody ukázaly výrazně lepší plísňové morfologie (P hodnota pomocí chi-kvadrát testu: 0.001) následovně: 33 (66%) oproti 32 (64%), 33 (66%) oproti 39 (78%), a 22 (44%) versus 31 (62%), resp. Ostatní plísňové skvrny používá pro Madurella mycetomatis byl Gridley skvrna o plísňové morfologie a barvení kvalitu kosti odvápňuje s 10% EDTA, 5% HNO3 a 5% HCl pomocí konvenční a mikrovlnné metody, které ukázaly výrazně lepší zjištění (P hodnota pomocí chi-kvadrát testu: 0.003) takto: 43 (86%) a 41 (82%), 32 (64%) versus 34 (68%) a 23 (46%) oproti 35 (70%), resp. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. Obrázek 1 ukazuje výsledky barvení za použití různých odvápňovacích činidel a podmínek.

Obrázek 1

Demonstrace výsledky barvení pomocí různých odvápňuje činidla a podmínky.

4. Diskuse

histopatologického identifikace původce Madurella mycetomatis je dobře zaveden jako je zlatý standard postup; nicméně, tvrdé tkáně a kosti vyžadují zvláštní odvápnění zachovat strukturu tkání a původce morfologie. Původci mohou být identifikovány pomocí hematoxylin a eosin (HE) a houby zvláštní skvrny, takže kosti vyžaduje standardní odvápnění protokol, který chrání tkáně, původce morfologie, a skvrna schopnosti. Odvápnění kostí je zdlouhavá technika. Vyžaduje to týdny a zachování konfigurace tkáně závisí na dokonalosti a rychlosti postupu odvápnění. Pro urychlení procesu odvápnění byl realizován nový proces využívající mikrovlnnou troubu . Výběr odvápňuje agent a způsobem, který je v podstatě určen vážnost metody a možné využití mikrovlnné energie v histologické techniky byly poprvé doložena Mayers v roce 1970. Tento systém nonionizing emisní metody myšlenka urychlit proces odvápnění . Molekulární kinetika pak způsobuje produkci změny energie, která trvá, dokud se záření nezastaví . V této studii, odvápnění times pro mikrovlnná trouba-zvýšená odvápnění a konvenční postup odvápnění bylo 29 a 120 hodin s 10% EDTA (pH 7.4), tři hodiny a sedm hodin s 5% kyseliny dusičné, a pět a osm hodin s 5% HCl, resp. Je zřejmé, že mikrovlnná metoda odvápnění kostní tkáně postižené infekcí mycetomem byla výrazně rychlejší než konvenční metoda. Také 5% kyselina dusičná měla rychlejší odvápňovací schopnost následovanou 5% kyselinou chlorovodíkovou a poté EDTA (pH 7,4) pro obě metody. Pitol et al. použil domů mikrovlnná trouba pro odstranění vápníku z krysích kostí o 8,5% EDTA roztok a zobrazí se pokles o zkušební dobu 45 dnů v konvenčním procesu do 48 h v mikrovlnné troubě-asistované proces. V této práci trvalo 10% roztok EDTA 120 hodin konvenční metodou a 29 hodin za použití mikrovln k dosažení úplné odvápnění kostní tkáně postižené infekcí mycetomem. Koncentrace EDTA v našem experimentu byla více než Pitol et al.studie. Kromě rozdílů ve velikosti, tloušťce a typech kosti to mohou být možná vysvětlení pro zvýšení doby odvápnění v Pitol et al.studie, která byla v našem prostředí snížena. Kromě toho odvápnění kosti postižené infekcí mycetomem konvenční metodou s použitím 5% kyseliny dusičné trvalo sedm hodin, zatímco metoda mikrovlnné trouby trvala tři hodiny. Srovnatelných výsledků dosáhly Balaton a Loget . Navíc v tomto výzkumu byly časy odvápnění sníženy z jiných studií. Na odvápnění times pro konvenční a mikrovlnné metody, v rozmezí od jednoho dne a čtyři hodiny až 5 dnů a jsou považovány za nízké ve srovnání s jinými studiemi hlodavec kostí, které byly hlášeny v období mezi 2 a 7 dny kyseliny-odvápňuje řešení a 10% EDTA (pH 7.4), resp. Shibata a jeho skupina hlášeny téměř podobné odvápnění časy, které se pohybovaly od 1 dne do 7 dnů s 10% HCl, 10% kyselina dusičná, 10% EDTA. Používali však kyselé odvápňovače s vyššími koncentracemi . Uma a kol. hodnoceny účinky čtyř různých odvápňuje tekutin pomocí mikrovlnné odvápnění v krysích kostí a uvádí 1 až 1,5 dne pro 5% kyseliny dusičné a 7% HCl/2% EDTA. 10% EDTA však trvalo 14 až 26 dní podle typu kosti . V těchto studiích se Typ kosti, povaha a velikost lišily a lišily se od zde analyzovaných. Odvápňovací postup byl klíčovým důvodem nadřazenosti tkáňové části a přesnosti barvení. Philipp et al. (2019) popsal, že metoda odvápnění způsobuje významné morfologické změny, které mění strukturu bílkovin a ovlivňují schopnost barvení tkáně . V naší studii byla kost ošetřena 5% kyselinou dusičnou rutinní manuální metodou a došlo k otokům v měkkých tkáních a ztrátě jaderného a houbového barvení ve srovnání s odvápněním pomocí mikrovlnné trouby. Kyselina-odvápňovací činidla obvykle narušují stálost kostí a měkkých tkání. Tyto speciální účinky v 5% kyselině dusičné jsou způsobeny dobou trvání a kyselostí roztoku. Rychlejší odvápnění tak způsobí větší zranění a větší účinky u H&E a houbových speciálních skvrn. Několik hub může být prokázána pomocí histologických řezů pomocí histochemické skvrny, jako jsou Grocott je methenamin-stříbro (GMS) skvrny a/nebo Gridley (GS) skvrna . Některé houby mohou být přesně prokázána v tkáni na základě morfologické struktury; nicméně, uznání, účinnost tendenci zmenšit po delší fixace a odvápnění pomocí konvenčních metod . V této studii, mikrovlnná trouba asistované odvápnění dal vynikající barvení ve srovnání s konvenční metody pro morfologie pomocí H&E a plísňové zvláštní skvrna, kde 10% EDTA byl roztok, který nejlépe zachovalé tkáně struktury a plísňových skvrn možnost i přes dlouhý čas na odvápnění.

5. Závěr a doporučení

odvápnění vylepšené použitím mikrovlnné trouby je novou technikou odvápnění. Tato technika byla zkoumána v kostní tkáni postižené s Madurella mycetomatis infekce pomocí 10% EDTA, 5% kyselina dusičná, 5% kyselina chlorovodíková, jak odvápňuje tekutin. To bylo ve srovnání s konvenční odvápnění při pokojové teplotě k určení rychlosti a odvápnění tkání morfologie pomocí Mayer ‚ s hematoxylin a eosin stain pro strukturu kostí a Grocott a Gridley skvrny na houbové morfologie. Bylo dosaženo lepších výsledků ve srovnání s konvenční metodou jak v morfologii buněk, tak v sporech hub a hyf se sníženým jasem hub při pokojové teplotě. Toto zjištění může pomoci vyvinout vhodné protokoly pro analýzy kostní tkáně postižené mycetomovou infekcí.

6. Omezení této studie

větší velikost vzorku by poskytla přesvědčivější výsledky. Také časy odebrané pro odvápnění se pravděpodobně budou lišit, pokud se použijí různé hmotnosti kostí a vzorky kostí jiné než ruce, protože doba odvápnění závisí na velikosti a strukturální hustotě tvrdé tkáně. Konečně, protože jsme použili domácí mikrovlnnou troubu, naše teplotní záznamy mohly být pouze přibližné.

dostupnost dat

datové sady vytvořené během současné studie jsou k dispozici od příslušného autora na přiměřenou žádost.

Etické Schválení

Tato studie byla schválena Institucionální Review Board Fakulty Lékařské Laboratoře Vědy, University of Al Neelain.

střet zájmů

autor prohlašuje, že nedochází ke střetu zájmů.

Poděkování

autor si přeje vyjádřit svou upřímnou vděčnost k zaměstnancům Mycetom Research Centre, University of Khartoum, Khartoum, Súdán, a zvláštní uznání profesorů Ahmed Hassan Fahal a Ahmed Mohammed El Hassan, emeritní profesor patologie, za jejich pomoc.

doplňkové materiály

materiály a činidla použitá na podporu zjištění této studie jsou zahrnuty do doplňkových informací. (Doplňkové Materiály)