TUNEL assay je nejvíce běžně používá k detekci buněk podstupujících apoptózu, což je forma programované buněčné smrti. Apoptóza je důležitý biologický proces během vývoje a pro udržení tkáňové homeostázy. Barvení tunelem umožňuje vizualizaci a kvantifikaci apoptotických buněk. To pomáhá vědcům testovat účinnost nových způsobů léčby poruch, při nichž je apoptóza buď inhibována, jako u rakoviny, nebo zvýšena, jako u neurodegenerace.
Toto video vám vysvětlí, jak TUNEL assay mohou být použity k označení buněk podstupujících apoptózu, krok-za-krokem protokol pro provádění této metody v tkáňových řezech, a jak vědci používají tuto techniku pochopit mechanismy buněčné smrti.
než se ponoříme do protokolu tunelového testu, pojďme diskutovat o principech této techniky.
jednou z mnoha charakteristických charakteristik apoptózy je fragmentace DNA. Jak dochází k fragmentaci DNA? Apoptóza se provádí enzymy nazývanými kaspázy přítomnými v cytosolu. Jejich primární úlohou je štěpit proteiny za účelem demontáže buňky. Kromě toho kaspázy aktivují enzym zvaný kaspázou aktivovaná Dnáza nebo CAD tím, že ji oddělí od svého inhibitoru—ICAD. Aktivovaný CAD je endonukleáza, která cestuje do jádra a štěpí chromozomální DNA.
Štěpení DNA v konečném důsledku způsobuje akumulaci DNA fragmenty s vruby končí, a TUNEL assay neonově štítky tyto vruby konce fragmentované DNA, což umožňuje vědcům k detekci apoptózy. Ale jak se to stane? K tomu musíte pochopit reakci tunelu. TUNEL je zkratka pro terminální deoxynukleotidyltransferázou zprostředkované dUTP nick-end značení. Dva hlavní TUNEL činidla jsou terminal deoxynucleotidyl transferase, nebo TdT, a deoxyuridine triphosphate, nebo dUTP, které mohou být fluorescenčně označeny pro snadnou detekci.
abychom pochopili tunelovou reakci, vraťme se k apoptotickým buňkám s fragmenty DNA. Tyto štípané fragmenty mají volné 3′ hydroxylové skupiny. Jakmile přidáte TUNEL činidla pro vzorek obsahující apoptotických buněk, fluorescenčně značené dUTPs připojit na tyto 3′ hydroxylové skupiny s pomocí katalyzátoru enzymu TdT. Buňky obarvené tímto postupem se nazývají tunelové pozitivní buňky, které pak mohou být vizualizovány pomocí fluorescenční mikroskopie.
Nyní, když pochopíte základní principy a koncepty za testem tunelu, nastíníme obecný protokol pro provádění této techniky v tkáňových sekcích. Hlavní kroky TUNEL assay patří stanovení tkáně zájem, permeabilization tkáně, přidání TUNEL činidla, zastavení TUNEL reakce, a konečně analýzy.
nejprve musí být tkáň zájmu fixována, aby se zachovaly biologické struktury. Fixace funguje síťováním proteinů v buňkách. Pro test tunelu mohou být tkáně fixovány přidáním do roztoku obsahujícího 4% paraformaldehydu po dobu 4-24 hodin při 4°C. po fixaci kryosekce tkáně na tenké plátky 10 µm nebo méně.
dalším krokem je permeabilizace, která umožňuje reagencím, jako je enzym TdT, proniknout do buněčného jádra. Permeabilization tkáňových řezů může být provedena přidáním tkáně na proteinázu K řešení pro 5-15 minut při 37°C. Opláchněte tkáňových řezů s fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku na třepačce po dobu 15-30 minut při pokojové teplotě.
Následující permeabilization, TdT enzymu a fluorescenčně značené dUTPs jsou přidány do části tkáně, spolu s označení buffer obsahující kobalt, který se chová jako kofaktor pro TUNEL reakce. Společně se směs reakce tunelu a tkáňový úsek inkubují po dobu 1-3 hodin při 37°C a chrání před světlem, aby se zabránilo vyblednutí fluorescence.
Po inkubaci, stop pufru je přidáno k řezu tkáně, přestane TUNEL reakce, a po krátké inkubační úseky jsou umyty s fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku. Konečně, tkáňové řezy barveny pomocí fluorescenčně označených dUTP jsou zobrazeny pomocí fluorescenční mikroskopie, a posuzováno pro lokalizaci TUNEL pozitivních buněk v dané tkáni. Jeden může kvantifikovat buněčnou smrt jednoduše počítáním procenta tunelových pozitivních buněk v dané tkáňové sekci.
Nyní, když jste viděli, jak provádět TUNEL assay pro detekci apoptotických buněk, pojďme diskutovat o tom, jak tento test může být použit k řešení otázky cell biology.
buněčná smrt nastává jako normální součást vývoje pro vyřezávání tkání a struktur a pro eliminaci zbytečných buněk. Proto vědci, kteří se zajímají o tento jev, studují vliv prenatální expozice různým látkám na apoptózu během vývoje. Zde se vědci zajímali o zkoumání vlivu prenatální expozice alkoholu na vývoj mozku. Výsledky TUNEL barvení provádí na mozek plodu odhalila zvýšené apoptózy v tkáních, které byly prenatálně vystaveny alkoholu, ve srovnání s kontrolními zvířaty.
vědci také používají test TUNEL k vyšetření apoptózy v reakci na bakteriální infekci. V tomto experimentu vědci vyvinuli model pneumonie injekcí myší Pseudomonas aeruginosa, který indukuje zánět plic. Poté byla odstraněna plicní tkáň a bylo provedeno barvení tunelem, aby se vyšetřila apoptóza v reakci na bakteriální infekci. Výsledky ukazují, že apoptotická buněčná smrt se zvýšila u myší vystavených bakteriím ve srovnání s kontrolními zvířaty.
a konečně, barvení tunelů lze použít na vzorky lidských nádorů, aby se určila citlivost nádoru na léky. V tomto příkladu byly vzorky nádorů odebrány od lidských pacientů a kultivovány ex vivo. Dále byli léčeni preklinickými léky a hodnoceni na odpověď pomocí testu TUNEL. Získané údaje ukazují, že léčba lékem, který inhibuje Protein 90 tepelného šoku, významně zvyšuje apoptózu v nádorové tkáni.
právě jste sledovali video JoVE o použití testu TUNEL k detekci buněk podstupujících apoptózu. Toto video přezkoumalo principy barvení tunelu a postupný protokol k provedení testu tunelu na tkáňových řezech. Také jsme přezkoumali, jak lze tuto metodu použít k pochopení programované buněčné smrti během vývoje a nemoci. Jako vždy, díky za sledování!
