10.4.2 trehaloosia nisäkässolujen kryosäilytykseen
Kryosäilytystä on yleisesti käytetty solujen säilyttämiseen pitkiä aikoja erittäin alhaisissa lämpötiloissa. Jäätymisen ja sulamisen aikana tapahtuvat fyysiset muutokset voivat kuitenkin olla haitallisia solujen selviytymiselle ja toiminnalle. Siksi soluihin on lisättävä kryosuoja-aineita kryosäilytyksen aikana. Trehaloosin käyttö solujen kryoproteiinina syntyi ajatuksesta, että polyhydroksiyhdisteitä tarvitaan solukalvon molemmin puolin, jotta solut säilyvät pidempään . Useat ryhmät ovat tutkineet trehaloosia eri ihmissolujen kryopreservaation suojana.
Beattie ym. toi trehaloosia yhdessä DMSO: n kanssa haiman Langerhansin soluihin termotrooppisen nestefaasinsiirron avulla . Trehaloosia sisältänyt kryopreservaatio johti 92%: n palautumiseen aikuisista luodoista, kun taas vain 58%: n palautuminen pelkällä DMSO: lla saavutettiin. Trehaloosia sisältävien kryopressiivisten saarten siirteissä oli neljätoista kertaa enemmän insuliinia kuin niissä, joissa ei ollut trehaloosia. Trehaloosia sisältävien ihmisen sikiöaikaisten saartomaisten soluryppäiden (ICCs) talteenotto oli 94%, kun se oli vain 42% niillä, joilla ei ollut trehaloosia. Kun trehaloosia siirrettiin nakuhiirille, ICC: n kryosäilytettyjen siirteiden insuliinipitoisuus 15-kertaistui. Nämä tulokset osoittavat, että trehaloosin lisääminen kryopreservaattoriksi johtaa hyvin korkeaan ihmisen haiman endokriinisen kudoksen eloonjäämisasteeseen.
kasvovesi ja työkaverit toivat nisäkässoluihin pieniä trehaloosipitoisuuksia käyttämällä geenimuunneltua versiota huokosia muodostavasta alfa-hemolysiiniproteiinista ja havaitsivat, että solunsisäinen trehaloosi voi parantaa näiden solujen selviytymistä syväjäädytyksen aikana . Hiiren fibroblastien ja ihmisen keratinosyyttien eloonjäämisprosentit olivat 80% ja 70%, kun solunsisäinen trehaloosipitoisuus oli 0, 2 M. Solunsisäisellä trehaloosilla havaittiin olevan myös suotuisa vaikutus kuivattujen nisäkässolujen kalvonkestävyyteen, ja yli 90%: n palautuminen ehjästä plasmakalvosta havaittiin, kun soluja kuivatettiin ja säilytettiin leudoissa olosuhteissa useita viikkoja .
katenz ym. tutkivat trehaloosin vaikutusta ihmisen maksasolujen kylmäsäilytykseen. . 10% DMSO: lla ja 0,2 M trehaloosilla kasvatusalustassa jäädytetyt maksasolut osoittivat merkittävää parannusta solujen sulamisen jälkeisessä elinkelpoisuudessa ja pinnoitustehokkuudessa verrattuna pelkkään DMSO: hon. Trehaloosin esiintyminen kryopreservaation aikana johti myös siihen liittyneiden solujen kokonaisproteiinipitoisuuden nousuun, albumiinin erityksen suurenemiseen ja aspartaattiaminotransferaasin pienenemiseen sulamisen jälkeen.
kantasolut ovat tärkeitä välineitä hematopoieesin tutkimisessa, uusien hoitostrategioiden kehittämisessä sekä tiettyjen sairauksien mallijärjestelmissä. Kylmäsäilytyksen kehittymisestä huolimatta sulamisen jälkeinen solukuolema on edelleen suuri ongelma. Martinetti ym. käytetään trehaloosia kryopreservoimaan puhdasta hematopoieettista kantasolua ja kantasoluja ääreisverestä, jotta estetään soluhäviö, joka tapahtuu normaalin kryosäilytyksen aikana . Pintarungon merkkiaineen CD34 ilmentymistä arvioitiin ja 1 M trehaloosia todettiin parantavan kryosuojausta CD34+ – soluille, joilla on suurempi solumäärä ja solujen elinkyky verrattuna tavanomaiseen DMSO-pakastusmenetelmään. Lisäksi lyhyemmän ja pidemmän ajan kryopreservointi trehaloosilla säilytti CD34 + – solujen kyvyn erilaistua megakaryopoieettisiksi soluiksi sulamisen jälkeen. Nämä tulokset viittaavat trehaloosin kykyyn säilyttää kantasolujen elinkelpoisuus ja toiminta kryoproteiinina käytettynä.
punasolujen (RBC) ja verihiutaleiden pitkäaikaissäilyttämisellä, vaikka niiden elinkelpoisuus säilyy korkeana, on merkittäviä vaikutuksia verensiirtoon ja kliiniseen lääketieteeseen. Satpathy ym. kuvattu menetelmä RBC: n lataamiseksi trehaloosilla solunulkoisesta väliaineesta käyttäen osmoottista epätasapainoa ja fosfolipidifaasitransitiota, joka johti 40 mM: n trehaloosipitoisuuksiin solunsisäisessä liuoksessa . Trehaloosin havaittiin antavan osmoottisen suojan RBC: lle pitempään. Trehaloosipainotteisten RBC: iden kylmäkuivaus, jota seurasi nesteytys, johti 55%: n eloonjäämiseen ja morfologian säilymiseen. Elossa olevat solut syntetisoivat ATP: tä ja 2,3-difosfoglyseraattia (DPG), ja niiden methemoglobiinipitoisuus oli alhainen. SOD: n ja katalaasin aktiivisuus ja hemoglobiinin sekundaarirakenne kylmäkuivatuissa punasoluissa olivat kaikki hyvin samanlaisia kuin tuoreissa punasoluissa. Tämä tutkimus osoitti, että trehaloosikuormitus oli tarpeen hemoglobiinin vakauttamiseksi ja tarjosi tärkeän askeleen kohti punasolujen kryosäilytystä.
ihmisen verihiutaleiden normaali säilytysaika veripankkeihin on 5 päivää, minkä jälkeen ne hävitetään, mikä johtaa krooniseen verensiirtoon tarvittavien verihiutaleiden puutteeseen. Pyrkimyksenä verihiutaleiden syväjäädytykseen pidemmäksi aikaa, Wolkers et al. kuvattu menetelmä trehaloosin lisäämiseksi ihmisen verihiutaleiden sytoplasmaan . Trehaloosin havaittiin nousevan helposti ihmisen verihiutaleista 37°C: n lämpötilassa, jolloin lataustehokkuus oli yli 50%. Pakastekuivaus ja trehaloosipainotteisten verihiutaleiden nesteytys johtivat siihen, että ehjät verihiutaleet palautuivat erinomaisesti 85%: n eloonjäämisprosentilla. Nämä verihiutaleet reagoivat lähes samalla tavalla kuin tuoreet verihiutaleet kohti agonisteja, kuten trombiinia, ADP: tä, kollageenia ja ristosetiinia. Trehaloosipainotteisten verihiutaleiden kalvomikrodomiinit ja proteiinikomponentit säilyivät ehjinä pakastekuivauksen ja nesteytyksen jälkeen.
trehaloosin suojavaikutus osoitettiin myös sarveiskalvon epiteelisoluissa. Viljeltyjen sarveiskalvon epiteelisolujen esiinkubointi trehaloosilla ja sen jälkeen kuivaus johtivat kuolleiden solujen prosenttiosuuden merkittävään vähenemiseen verrattuna kontrolliaineeseen . Suojavaikutus vahvistettiin myös ex vivo enukleatuneissa sian silmissä, joissa trehaloosilla inkuboitu kudos oli näkyvästi sileämpää . Nämä tulokset osoittavat trehaloosin hyödyllisyyden silmätautien hoidossa ja sen mahdollisen käytön silmätippana kuivasilmäisyyden hoidossa.
Yamaguchi ym.ovat osoittaneet Trehaloosin käytön organellien kryosäilytykseen., joka käytti trehaloosia jäätyneiden mitokondrioiden kryoproteesina . Trehaloosin läsnä ollessa jäädytetyt mitokondriot osoittivat mitokondrion ulkokalvo (MOM) eheyttä ja reagointikykyä BCL-2-perheen proteiineihin, jotka ovat samanlaisia kuin tuoreissa mitokondrioissa. Myös ultrarakenne, ATP-synteesi, transmembraanipotentiaali, kalsiumin aiheuttama turvotus sekä esiasteproteiinien tuonti ja käsittely säilyivät trehaloosin läsnä ollessa. Tämä poikkeaa tavallisesta sakkaroosi-mannitolipuskurista, jota käytetään mitokondrioiden jäädyttämiseen ja joka usein vuotaa. Näin trehaloosi pystyi säilyttämään suurimman osan mitokondrioiden biologisista ominaisuuksista ja trehaloosi-jäätyneitä mitokondrioita voidaan käyttää apoptoosin ja muiden äidin eheyteen nojaavien mitokondrioiden tutkimiseen.
trehaloosia on käytetty pitkään elinten säilyttämiseen. Wadan ryhmä kehitti” et-Kyoto solution ” – ratkaisun koiran keuhkojen säilyttämiseksi >30 tuntia vaikuttamatta endoteelisolujen ja verisuoniston suorituskykyyn . Myös rokotteiden ja vasta-aineiden pitkäaikainen stabilointi ja säilyminen on saavutettu trehaloosin avulla.
