N-terminaalinen sekvensointi, jota usein kutsutaan Edman-sekvensoinniksi tai Edman-hajoamiseksi, on tärkeä tekniikka proteiinien tutkimuksessa ja on edelleen ainutlaatuinen lähestymistapa, joka voi tuottaa uusia proteiinisekvenssitietoja. Se on myös edullinen tekniikka nopean proteiinin ilmentymisen vahvistamiseen.
tämän menetelmän kemian esitteli vuonna 1950 P. Edman Lundin yliopistosta Ruotsista, ja sitä kehitettiin edelleen hänen työskennellessään Melbournessa, Australiassa, ja sen uskotaan olevan ensimmäinen automatisoitu peptidien sekvensointilaite.
Edmanin kemia
Kuva 1. Edman degradation chemistry For N-terminal protein sequencing.
kemialliset reaktiot, joissa saadaan hydrolisoitua N-terminaalista merkittyä aminohappoa, on esitetty kuvassa 1. Jokainen sykli sisältää olennaisesti 3 vaihetta:
- fenyyli-isotiosyanaatin (PITC, Edman-reagenssi) liittäminen polypeptidiketjun alfa-amiiniin perusolosuhteissa fenyylitiokarbamyyli (PTC) – osan muodostamiseksi.
- pilkkoutuminen lievissä happamissa olosuhteissa tuottaa polypeptidiin vapaan aminoterminaalin ja additioidun aniliinitiatsolinonin (ATZ) aminohapon.
- jälkimmäinen uutetaan ja muutetaan edelleen stabiilimmaksi fenyylitiohydantoiinijohdannaiseksi (PTH).
saatu PTH-jäämä analysoidaan HPLC: n ja retentioaikojen avulla verrattuna standardin PTH-aminohappoihin.
sivureaktiot ja sivutuotteet
Sekvensointisyklin kemia ja work up on hyvin kontrolloitua ja tuottaa täydellisesti määriteltyjä lajeja, muutamia sivutuotteita havaitaan analyysin aikana.
kuten kuviosta 2 käy ilmi, ne ovat peräisin pääasiassa Pitc-hydrolyysistä ja metanolyysistä syklin aikana, ja niihin kuuluvat difenyylitiourea (DPTU), n-fenyyli, O-metyylitiourea (PMTC) ja difenyyliurea (DPU), sivutuotteet, jotka uuttavat ja eluoivat yhdessä PTH-aminohappojen kanssa.
