EuroMAbNet: Euroopan monoklonaaliset vasta-Aineverkosto

protokollat

Hybridooman tuotanto

hybridooma on solulinja, joka syntyy yhdestä hybridisolusta, joka pystyy erittämään monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen yhdelle antigeenisi epitoopille pysyvästi viljelmässä. Hybridisolu syntyy fuusioimalla immunisoidusta eläimestä (yleensä hiirestä, rotasta tai kanista) spesifistä vasta-ainetta tuottavaa B-solua, jolla on rajallinen elinikä, soluun, joka on peräisin viljellystä ”kuolemattomasta” myeloomasolulinjasta (esim.hiirestä NS-1 tai NS-0).

hiiren hybridisolun tuotanto

fuusioprosessin aikana B-solut eristetään hiiren pernasta, sekoitetaan hiiren myeloomasolulinjaan ja fuusio indusoidaan polyetyleeniglykolilla (PEG, KS.Liite I). (Relevanttia myeloomalinjaa käytetään, kun käytetään muiden eläinlajien B-soluja). Tuloksena olevat hybridomat viljellään sitten Kudosviljelyaineessa, joka sisältää Hypoksatiinia, Aminopteriinia, Tymidiiniä (HAT), vaihe, joka tappaa kaikki fuusioimattomat myeloomasolut, jotka saattavat kasvaa ulos muista heikommista hybridoomasoluista. Fuusioimattomilla B-soluilla on rajallinen jakautumiskyky, ja ne kuolevat luonnollisesti viljelmässä. Kymmenen päivän kuluttua fuusioprosessista kerätään supernatanttiviljelmä ja testataan halutun vasta-aineen esiintyminen.

Solufuusion Kaavamainen esitys

tarvittavat laitteet

• steriili ympäristö, jossa valmistetaan ja käsitellään soluja (laminaarinen virtauskaappi tai luokan II kaappi)
• inkubaattori, joka on asetettu 37ºC: seen, jossa on 5% CO2 ja kosteus 95%
• Käänteinen mikroskooppi
• 37ºC: sinen vesikylpy, joka voidaan sijoittaa kaappiin
• sentrifugi, jossa on kääntyvä roottori
• steriilit dissektiovälineet-ihanteellisesti kaksi sarjaa-joissa kummassakin on kaksi paria saksia ja pihtejä (joista toinen on kaareva ja toinen tylppäpäinen).
• 75 ml kudosviljelypulloja-Ref. 15430641
• 24 kaivon Haukkalevyt-Ref. 353047
• steriilit pipetit
• pipetin täyteaine
• steriilit pasteur-pipetit
• ajastin

väliaine ja muut reagenssit (Katso lisätietoja lisäyksestä A))

• rpmi 1640 bikarbonaatti puskuroitu, l-glutamiinilla (Lonza Ref. BE12-702F)
• rpmi 1640 Hepes puskuroitu, ilman L-glutamiinia
• hyvälaatuinen (erätestattu) sikojen Nautaseerumi (Genycell Ref. GCS0101-500)
• penisilliini / streptomysiini (Gibco Ref. 15070-063)
• Ultroser G (Pall Ref. 15950-017)
• hattu (Hypoksatiini, Aminopteriini, Tymidiini) (Gibco Ref. 21060-017)
• PEG 1500 (Roche Ref. 10783641001)

ennen kuin aloitat (Katso lisätietoja lisäyksestä A)

• tee 500 ml a
• tee 500 ml keskipitkän A+
• tee 100 ml keskipitkän B
• tee 100 ml keskipitkän C
• tee 500 ml keskipitkän d

myeloomasolujen sulaminen ja kasvu

sulata myeloomasolulinja ja kasvaa keskipitkällä A. Käytä seuraavaa menetelmää myeloomasolulinjan sulattamiseen ja viljelyyn.

• ota myeloomasoluja sisältävä pakastepullo LN2-varastosta.
• laita kennot 37ºC: n vesihauteeseen.
• pidä jäätymispullon kansi veden pinnan yläpuolella kontaminaatiomahdollisuuksien vähentämiseksi.
• kun solut ovat lähes sulaneet (vain pieni pala jäätä jäljellä), ne siirtyvät kudosviljelmään.
• pyyhi injektiopullon ulkopinta 70-prosenttisella etanolilla ja poista sen yläosa.
• poista solususpensio varovasti steriilillä Pasteur-pipetillä.
• siirrä sisältö sentrifugiputkeen, jossa on 10 ml väliainetta A (KS.lisäys A)
• pyöräytä solususpensiota kevyesti 300 g: n painolla 5 minuutin ajan.
• supernatantti poistetaan, solut suspendoidaan uudelleen 10 ml: aan tuoretta elatusainetta A ja pannaan pieneen (25cm2) pulloon.
• otetaan 1 ml suspensiota alkuperäisestä pullosta ja lisätään toiseen pulloon, jossa on 9mls väliainetta A. Tämä varmistaa, että jos ensimmäisen pullon pitoisuus on liian suuri, on saatavilla toinen (alempi) solupitoisuus.
• laita pullot CO2-inkubaattoriin. Muista jättää pullon Kannet hieman auki kaasujen vaihtamiseksi.

fuusioprosessi

kolme päivää ennen – valmista myeloomasolut fuusiota varten

myeloomasolujen tulee olla eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, kun käytät niitä ja tämä vaatii kokemusta. Jos kuitenkin otat kaksi 75 cm2:n pulloa myeloomasoluja, joista toinen laimennetaan 1:40: ssä ja toinen 1: 60: ssä (KS.jäljempänä), 3 päivää ennen fuusiota, yhden pullon pitäisi olla ihanteellinen fuusion päivänä. (Lisäpullojen käyttöönotto tässä annettujen laimennosten ylä-ja alapuolella antaa sinulle tarvittavan kokemuksen arvioida myeloomasolujen kasvunopeutta myöhempiä fuusioita varten).

päivää ennen – valmista liuos

seuraavat valmisteet on valmistettava ja esilämmitettävä 37ºC: seen (voit laittaa ne inkubaattoriin yön yli).

• kaksi x 200 ml väliainetta A+ kahdessa 75cm2 pullossa
• 100 ml väliainetta b
• 100 ml väliainetta C
• 1×4 ml PEG 1500 siirretään folioon käärittyyn (PEG on valoherkkä) steriili yleisvesikylpy
• pieni vesikylpy, valmistettu 200 ml: n dekantterilasiin, joka sisältää noin 100 ml tislattua vettä ja joka on ristitty riittävän leveällä teipillä, jotta 50 ml: n haukan putkea voidaan pitää pystyasennossa

fuusiopäivä

• tappaa hiiri (institutionaalisten ohjeiden mukaisesti), purkaa perna ja laittaa se steriiliin astiaan, joka sisältää 5 ml medium C.
• kaikki myöhemmät vaiheet on suoritettava laminaarisessa liesituulettimessa.

• laita perna ja väliaine petrimaljaan.
• perna pestään steriileillä pihdeillä. Poista mahdolliset kiinnikkeet ja siirrä perna toiseen petrimaljaan
• leikkaa perna kahtia. Pidä toinen puoli tylpällä pihdillä ja käyttämällä toista paria kaarevia pihtejä, kiusaa soluja varovasti pois pernakapselista ja ole varovainen poistamaan mahdollisimman monta solua. Toista käyttäen pernan jälkipuoliskoa
• Poista pernan kapselijätteet ja sekoita solut steriilillä Pasteur-pipetillä hyvin, mutta hyvin varovasti.
• siirrä solususpensio 15 ml: n putkeen ja huuhtele petrimalja vielä 5 ml: n väliainetta C ja lisää putkeen pernasoluja.
• laske myelooma-ja pernasolut.
• tarvitaan 1 myeloomasolun suhde jokaiseen 10 pernasoluun
• lisää myeloomasolut 50 ml: n kartiomaiseen putkeen.
• sentrifugoidaan sekä pernasoluja (15 ml: n putkessa) että myeloomasoluja (50 ml: n putkessa) 300 g: n ajan 10 minuutin ajan.
• molempien putkien supernatantti kaadetaan huolellisesti pois ja pelletit suspendoidaan varovasti 10mls väliainetta B. FBS: n puuttuminen ennen fuusioprosessin päättymistä on erittäin tärkeää, koska solut eivät sulaudu, jos FBS on läsnä)

• Yhdistä uudelleen suspendoidut pernasolut ja myeloomapelletit yhteen 50 ml: n sentrifugiputkeen.
• sentrifugoidaan 5 minuuttia 300 gramman painolla.
• kaada mahdollisimman paljon supernatanttia varovasti pois.
• sekoita sakka uudelleen naputtamalla putkea kevyesti penkillä. Älä flick pelletti tai pipetoida sitä, koska tämä jakaa soluja ympäri putken vähentää solujen numerot, jotka ovat käytettävissä sulakkeen.
• laita putki kotitekoiseen vesihauteeseen.
• lisätään 1, 2 ml PEG-liuosta tipoittain yhden minuutin aikana sekoittaen kevyesti muutaman pisaran välein.
• lisätään 1 ml medium B: tä tipoittain yhden minuutin aikana sekoittaen kevyesti muutaman pisaran välein.
• lisätään vielä 2 ml medium B: tä tippa kerrallaan kahden minuutin ajan sekoittaen kevyesti muutaman pisaran välein.
• lisätään vielä 4 ml medium B: tä tippa kerrallaan neljän minuutin ajan sekoittaen kevyesti muutaman pisaran välein.
• ajan päättyessä lisätään 8 ml väliainetta C.
• sentrifugoidaan soluputkea 5 minuutin ajan 300 g.
• supernatantti dekantoidaan huolellisesti ja suspendoidaan uudelleen 1 minuutin ajan 10 ml: lla väliainetta a+. Voit tehdä tämän lisäämällä muutaman ml väliainetta, jotta pelletti alkaa hajota. Ime nämä solumassat hyvin varovasti ja liiku pipetissä ylös ja alas. Karkota nämä solut ja toista prosessi. Ole hyvin lempeä, älä pakota pelletti toisistaan, sinulla voi olla pieniä möhkäleitä solujen valmistuttua. Solut ovat erittäin hauraita tässä vaiheessa.
• laita 10 milliä uudelleen suspendoitua fuusioseosta 190 ml: aan lämmintä väliainetta a +
• lopullinen tilavuus on 200 ml
• 1 ml tätä suspensiota jokaiseen 8 x 24 kaivon (2 ml) levyyn. (Yhteensä 192 kuoppaa)
• jätä levyt inkubaattoriin yön yli (noin 24 tuntia).

päivä fuusion jälkeen

• lisätään 8 ml hattua 200 ml: aan väliainetta a+.
• 1 ml tätä selektiivistä kasvualustaa laitetaan 8 levyn jokaiseen kaivoon.
• jätä levyt inkubaattoriin. Pesäkkeet näkyvät välillä 7-10 päivää

lisäys i

Viljelyaine A:
RPMI 1640-kasvualusta, jossa on L-glutamiinia (bikarbonaattipuskuroitu) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ penisilliini (100 U / ml) / streptomysiini (100 mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Viljelyaine A+:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)

Culture Medium B (no FBS):
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium C:
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium D:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)
+ HAT (Hypoxathine, Aminopterin, Thymidine) supplement which is usually 50X (dilute 10ml in 500mls of medium) (Gibco Ref. 21060-017)