Monivärivärjäystä fluoresoivilla väreillä käytetään aktiivisesti biologisten materiaalien (kuten proteiinien, lipidien, nukleiinihappojen ja ionien) jakautumisen tarkkailuun kudos-ja solututkimuksessa. Fluoresenssihavainnon ilmaisutekniikka on edennyt tasolle, jolla yksittäinen fluoresoiva värimolekyyli voidaan havaita parhaissa olosuhteissa. Tässä jaksossa tarkastellaan useita tärkeitä näkökohtia fluoresenssi lifetime imaging microscopy (FLIM), Uusi fluoresenssimikroskopiatekniikka. Monivärivärjäyksen lisäksi fluoresenssin elinkaarikuvausta voidaan hyödyntää myös niiden tekijöiden havainnollistamisessa, jotka vaikuttavat väriainemolekyylin fluoresenssin elinaikaominaisuuksiin eli molekyyliä ympäröivän ympäristön tilaan.
Aallonpituusspektroskopia
tavanomaisessa fluoresenssimikroskopiassa hyödynnetään fluoresoivien väriaineiden väriominaisuuksia, eli tunnistaminen perustuu väriaineiden välisiin fluoresenssispektristen ominaisuuksien eroihin. Tällä tekniikalla voidaan käyttää samanaikaisesti mikroskopiassa viittä tai kuutta väriainetta aallonpituusalueella ultravioletista Lähi-infrapunaan sekoittamatta värejä.
Elinikäspektroskopia
jokaisella fluoresoivalla väriaineella on oma elinaikansa jännittyneessä tilassa. Tunnistamalla eliniän erot on mahdollista erottaa jopa värit, joilla on sama fluoresoiva väri, sekä tunnistaa autofluoresenssi. Lisäksi suuria signaali-kohinakuvia voidaan saada käyttämällä anturia, jonka käyttöikä on hyvin pitkä verrattuna tavallisesti käytettävien fluoresoivien väriaineiden elinikään. Esimerkiksi platinakoproporfyriinin elinikä on millisekunnin luokkaa, kun taas tavallisten fluoresoivien väriaineiden elinikä on nanosekunnin luokkaa. Tällaisia suhteellisen pitkäikäisiä fluoresoivia väriaineita käytetään pian antureina DNA-tunnistuksessa siruista.
fluoresenssin elinkaarikuvauksen avulla on myös mahdollista saada tietoa molekyyleistä elävää solua tarkkailtaessa. Fluoresenssin elinikään vaikuttavia tekijöitä ovat ionien voimakkuus, hydrofobiset ominaisuudet, happipitoisuus, molekyylisidos ja molekyylien välinen vuorovaikutus, joka tapahtuu energian siirtyessä kahden proteiinin lähestyessä toisiaan. Elinikä on kuitenkin riippumaton väriainepitoisuudesta, valonjaosta, valon sironnasta ja herätevalon voimakkuudesta. Siksi fluoresenssin elinkaarikuvaus mahdollistaa tarkan ionikonsentraation mittauksen ja fluoresenssin Resonanssienergiansiirron (FRET) analyysin.
fluoresenssin elinkaarikuvaukseen on kaksi menetelmää: aika-domeeni-menetelmä ja taajuus-domeeni-menetelmä.
- Time-domain FLIM-joissakin tapauksissa fluoresenssikuva saadaan kuvanvahvistimen porttioperaatiolla pulssilaserilla tapahtuvan herätyksen jälkeen. Elinikä mitataan nanosekunneissa laserilla, jonka pulssin kesto on muutama sata picosekuntia ja nanosekuntitason suljin, koska herätetilan elinikä on yleensä 1-20 nanosekuntia. Nopea porttikuvan vahvistin on kaupallisesti saatavilla Hamamatsu Photonics K. K.: lta (Hamamatsu, Japani). Fluoresenssin elinikä kullakin pikselillä voidaan myös saada mittaamalla samalla vaihtelemalla portin avautumiseen kuluvaa viiveaikaa. Fluoresenssikuvat näytetään pseudoväreinä niiden eliniän mukaan.
- taajuusalueen FLIM-fluoresenssin elinikä lasketaan mittaamalla fluoresenssin vaihesiirto ja sen amplitudin aleneminen vahvistusmodulaattorilla varustetulla ilmaisimella, kun magnetointivalonlähteenä käytettävää laseria moduloidaan (1-200 megahertsiä). Mittaus voidaan tehdä joko laserkeilauksella (photomultiplier) tai CCD-laitteella (charge-coupled device).
Sovellukset
luotainta ympäröivä ympäristö havaitaan sen perusteella, että fluoresenssin elinikä on herkkä vetyionipitoisuuksille (pH), happi-ja kalsiumionipitoisuuksille. Molekyylien välistä sitoutumista tai vuorovaikutusta voidaan mitata myös yhdessä fretin kanssa.
Kalsiumionikonsentraatiokuvaus
kun kalsiumioni sitoutuu fluoresoivaan anturiin, kuten Fura-2: een, Fluo-3: een tai Kalsiumvihreään, sekä fluoresenssin elinikä että fluoresenssin voimakkuus muuttuvat. Tavanomainen ionikonsentraation mittausmenetelmä keskittyy voimakkuuden muutokseen. Kalsiumionikonsentraation muutoksen mukaan sitoutuneen ja sitoutumattoman kalsiumionin välinen väriaineiden suhde muuttuu, mikä johtaa näytteessä olevan mittauskohdan fluoresenssin eliniän muutokseen. Kalsiumionianturin lisäksi tätä tekniikkaa voidaan soveltaa myös pH: n ja muiden ionien kuten natriumionin ja magnesiumionin mittaamiseen.
Fluoresenssiresonanssienergiansiirto (FRET)
FRETIÄ tutkitaan parhaillaan vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) varianteilla (GFP, jolla on eri fluoresenssiväri). Fretin avulla voidaan mitata kahden fluoresenssiväreillä merkityn proteiinin välisiä vuorovaikutuksia (assosiaatiota tai dissosiaatiota). Luovuttaja fluoresoiva väriaine on lyhyempi magnetointi / emission aallonpituudet, jotka antavat energiaa acceptor fluoresenssi väriaine. Elinikä heräte valtion luovuttajan väriaine on vaihteleva riippuen siitä, onko hyväksyjä (väriaine vastaanottavan energian) olemassa. Elinikään perustuva mittaus mahdollistaa paremman kvantifioinnin, koska ei ole tarpeen ottaa huomioon fluoresenssin päällekkäisyyttä havaitsemisen aikana.
kliininen kuvantaminen
koska joillakin kudos-ja sytodiagnostisilla näytteillä on voimakas autofluoresenssi, on kokeiltu pitkän eliniän (jopa millisekunnit) antureita. Pitkäikäiset luotaimet ovat hyödyllisiä myös fluoresenssi in situ hybridisaatiossa (FISH), koska samanaikaisesti käytettävien värien määrä on rajoitettu tällä tekniikalla. Veren vetyionipitoisuus sekä hapen ja hiilidioksidin paineet on jo mitattu fluoresenssin eliniän perusteella, vaikka tällaiset mittaukset eivät ole vielä mahdollisia mikroskopiassa.
Internet Resources
- Center for Fluoresence Spectroscopy – isäntänä professori Joseph R. Lakowicz Marylandin yliopistossa, tämä sivusto on erinomainen resurssi tietoa fluoresenssi elinikäinen kuvantaminen ja muita näkökohtia fluoresenssi spektroskopia ja mikroskopia.
- Kentech Instruments-Kentech valmistaa korkeajännitteisiä solid state-pulssigeneraattoreita ja optisia aidattuja kuvantamisjärjestelmiä fluoresenssin elinkaarikuvaukseen.
- Hamamatsu Photonics-erinomaisen digitaalikamerajärjestelmävalikoimansa lisäksi Hamamatsu valmistaa myös valomonistimia, lumivyöryvalodiodeja ja suurnopeuksisia porttikuvavahvistimia.
- PRS BioSciences-erikoistunut biologiseen fluoresenssimikroskopiaan, PRS BioSciences valmistaa jälkimarkkinoilla ajan tasalla olevaa järjestelmää, joka voidaan mukauttaa moniin tutkimusmikroskooppeihin.
