G418

G418 (Genetiini, Invitrogeeni): liuotetaan veteen 200 mg/ml, steriloidaan suodattimella ja varastoidaan alikiintiöihin 4 °C: ssa.

clonNAT (nourseothricin, Werner BioAgents, Jena, Saksa): liuotetaan veteen 100 mg/ml, steriloidaan suodattimella ja säilytä aliquoteissa 4 °C: ssa.

Kanavaniini (l-Kanavaniinisulfaattisuola, Sigma, C-9758): liuotetaan veteen 100 mg/ml: ssa, steriloidaan suodattimella ja säilytetään aliquoteissa 4 °C: ssa.

tialysiini (S-(2-aminoetyyli)-l-Kysteiinihydrokloridi, Sigma, a-2636): Dissolve in water at 100 mg/ml, filter sterilize, and store in aliquots at 4 °C.

Amino acids supplement powder mixture for synthetic media (complete): Contains 3 g adenine (Sigma), 2 g uracil (ICN), 2 g inositol, 0.2 g para-aminobenzoic acid (Acros Organics), 2 g alanine, 2 g arginine, 2 g asparagine, 2 g aspartic acid, 2 g cysteine, 2 g glutamic acid, 2 g glutamine, 2 g glycine, 2 g histidine, 2 g isoleucine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g methionine, 2 g phenylalanine, 2 g proline, 2 g serine, 2 g threonine, 2 g tryptophan, 2 g tyrosine, and 2 g valine (Fisher). Drop-out (DO)jauheseos on yhdistelmä edellä mainituista ainesosista miinus sopiva täydennys. DO-jauheseosta käytetään kaksi grammaa väliainelitraa kohden.

Aminohappolisä sporulaatioalustalle: sisältää 2 g histidiiniä, 10 g leusiinia, 2 g lysiiniä, 2 g urasiilia; käytetään 0, 1 g aminohappolisää jauheseosta litrassa sporulaatioalustaa.

glukoosi (dekstroosi, Fisher): valmistetaan 40-prosenttinen liuos, Autoklaavi ja säilytetään huoneenlämmössä.

JEPD: Lisätään 120 mg adeniinia (Sigma), 10 g hiivauutetta, 20 g peptonia, 20 g bacto agaria (Bd Difco) 950 ml: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklavoinnin jälkeen lisätään 50 ml 40% glukoosiliuosta, sekoitetaan huolellisesti, jäähdytetään ~ 65 °C: seen ja kaadetaan levyjä.

YEPD + G418: jäähdytetään YEPD-liuos ~ 65 °C: seen, lisätään 1 ml G418-Kantaliuosta (lopullinen pitoisuus 200 mg/l), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyt.

YEPD + clonNAT: jäähdytetään yepd-liuos ~ 65 °C: seen, lisätään 1 ml clonNAT-Kantaliuosta (lopullinen pitoisuus 100 mg/l), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyt.

YEPD + G418 / klonnat: Jäähdytetään YEPD-väliaine ~ 65 °C: seen, lisätään 1 ml G418: AA (lopullinen pitoisuus 200 mg/l) ja 1 ml clonNAT-kantaliuoksia (lopullinen pitoisuus 100 mg/l), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyt.

rikastettu sporulaatio: lisätään 10 g kaliumasetaattia (Fisher), 1 g hiivauutetta, 0, 5 g glukoosia, 0, 1 g aminohappojen täydennysjauheseosta sporulaatiota varten, 20 g bacto agaria 1 l: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklavoinnin jälkeen jäähdytetään väliaine ~ 65 °C: seen, lisätään 250 µl G418-Kantaliuosta (lopullinen pitoisuus 50 mg/l), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyt.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + kanavaniini/tialysiini/G418: lisätään 1, 7 g hiivatyppiemästä, jossa on aminohappoja tai ammoniumsulfaattia (BD Difco), 1 g MSG (l-glutamiinihapon natriumsuolahydraatti, Sigma), 2 g aminohappojen täydennysjauheseos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vettä 250 ml: n pulloon. Lisätään 20 g bacto agaria 850 ml: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklaavi erikseen. Yhdistetään autoklavoidut liuokset, lisätään 50 ml 40% glukoosia, jäähdytetään väliaine ~ 65 °C: seen, lisätään 0, 5 ml kanavaniinia (50 mg/L), 0, 5 ml tialysiiniä (50 mg/l) ja 1 ml G418 (200 mg/l) kantaliuoksia, sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyjä. Ammoniumsulfaatti haittaa G418: n ja klonnatin toimintaa. Näin ollen näitä antibiootteja sisältävää synteettistä väliainetta valmistetaan mononatriumglutamiinihaposta typpilähteenä (Cheng et al., 2000).

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + kanavaniini/tialysiini/klonnat: lisätään 1, 7 g hiivatyppiemästä, jossa on aminohappoja tai ammoniumsulfaattia, 1 g MSG, 2 g aminohappoja täydennettävä jauheseos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vettä 250 ml: n pullossa. Lisätään 20 g bacto agaria 850 ml: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklaavi erikseen. Yhdistetään autoklavoidut liuokset, lisätään 50 ml 40% glukoosia, jäähdytetään väliaine ~ 65 °C: seen, lisätään 0.5 ml kanavaniinia (50 mg/l), 0, 5 ml tialysiiniä (50 mg/l) ja 1 ml clonNAT-Kantaliuosta (100 mg/l) sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyjä.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + kanavaniini/tialysiini/G418/klonnat: lisätään 1, 7 g hiivatyppiemästä, jossa on aminohappoja tai ammoniumsulfaattia, 1 g MSG, 2 g aminohappojen täydennysjauheseos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vettä 250 ml: n pullossa. Lisätään 20 g bacto agaria 850 ml: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklaavi erikseen. Yhdistetään autoklavoidut liuokset, lisätään 50 ml 40% glukoosia, jäähdytetään väliaine ~ 65 °C: seen, lisätään 0, 5 ml Kanavaniinia (50 mg/l), 0.5 ml tialysiiniä (50 mg/l), 1 ml G418 (200 mg/l) ja 1 ml clonNAT-Kantaliuosta (100 mg/l) sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyjä.

(SD/MSG) täydellinen: lisätään 1, 7 g hiivatyppiemästä, jossa on aminohappoja tai ammoniumsulfaattia, 1 g MSG, 2 g aminohappoja täydennettävä jauheseos (täydellinen), 100 ml vettä 250 ml: n pulloon. Lisätään 20 g bacto agaria 850 ml: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklaavi erikseen. Yhdistä autoklavoidut liuokset, lisää 50 ml 40% glukoosia, sekoita huolellisesti, jäähdytä väliaine ~ 65 °C: seen ja kaada levyt.

SD-His / Arg / Lys + kanavaniini / tialysiini: lisätään 6.7 g hiivatyppiemästä w / o-aminohapoilla (BD Difco), 2 g aminohappoja täydentävää jauheseosta (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vettä 250 ml: n pullossa. Lisätään 20 g bacto agaria 850 ml: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklaavi erikseen. Yhdistetään autoklavoidut liuokset, lisätään 50 ml 40% glukoosia, jäähdytetään väliaine ~ 65 °C: seen, lisätään 0, 5 ml kanavaniinia (50 mg/l) ja 0, 5 ml tialysiiniä (50 mg/l) kantaliuoksia, sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyt. Tämä väliaine ei sisällä lainkaan antibiootteja kuten G418 tai clonNAT ja siksi typen lähteenä käytetään ammoniumsulfaattia.

SD − Leu/Arg/Lys + kanavaniini/tialysiini: lisätään 6, 7 g hiivatyppiemästä, jossa on aminohappoja, 2 g aminohappojen täydennysjauheseosta (DO − Leu/Arg/Lys), 100 ml vettä 250 ml: n pullossa. Lisätään 20 g bacto agaria 850 ml: aan vettä 2 l: n pullossa. Autoklaavi erikseen. Yhdistetään autoklavoidut liuokset, lisätään 50 ml 40% glukoosia, jäähdytetään väliaine ~ 65 °C: seen, lisätään 0, 5 ml kanavaniinia (50 mg/l) ja 0, 5 ml tialysiiniä (50 mg/l) kantaliuoksia, sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan levyt.