Menetelmät proteiinin Puhdistus: 4 menetelmiä

tämä artikkeli valaisee neljää proteiinin puhdistusmenetelmää.

neljä proteiinin puhdistusmenetelmää ovat: (1) uutto (2) saostus ja differentiaalinen Liukoisuus (3)Ultrasentrifugointi ja (4) Kromatografiset menetelmät.

proteiinien puhdistuksessa käytetyt menetelmät voidaan karkeasti jakaa analyyttisiin ja preparatiivisiin menetelmiin.

ero ei ole tarkka, mutta ratkaiseva tekijä on proteiinin määrä, joka voidaan käytännössä puhdistaa tällä menetelmällä. Analyysimenetelmillä pyritään havaitsemaan ja tunnistamaan proteiini seoksessa, kun taas preparatiivisilla menetelmillä pyritään tuottamaan suuria määriä proteiinia muihin tarkoituksiin, kuten rakennebiologiaan tai teolliseen käyttöön. Yleensä preparatiivisia menetelmiä voidaan käyttää analyyttisissä sovelluksissa, mutta ei toisinpäin.

menetelmä # 1. Louhinta:

lähteestä riippuen proteiini on tuotava liuokseen rikkomalla sitä sisältävä kudos tai solut. Tämän saavuttamiseksi on olemassa useita menetelmiä; toistuva jäädyttäminen ja sulaminen, sonikointi, homogenointi korkeapaineella tai orgaanisten liuottimien läpäisevyys. Valintatapa riippuu siitä, kuinka hauras proteiini on ja kuinka tukevia solut ovat.

tämän uuttoprosessin jälkeen liuottimeen tulee liukoinen proteiini, joka voidaan erottaa solukalvoista, DNA: sta jne. sentrifugoimalla. Uuttoprosessissa erotetaan myös proteaaseja,jotka alkavat pilkkoa liuoksessa olevia proteiineja. Jos proteiini on herkkä proteolyysille, on yleensä suotavaa edetä nopeasti ja pitää uute jäähdytettynä proteolyysin hidastamiseksi.

Menetelmä # 2. Saostuminen ja differentiaalinen Liukoisuus:

bulkkiproteiinien puhdistuksessa yleinen ensimmäinen vaihe proteiinien eristämiseksi on saostaminen ammoniumsulfaatilla (NH4)2SO4. Tämä tapahtuu lisäämällä yhä suurempia määriä ammoniumsulfaattia ja keräämällä saostuvan proteiinin eri fraktioita. Yksi etu tässä menetelmässä on, että se voidaan suorittaa edullisesti hyvin suuria määriä.

ensimmäiset puhdistettavat proteiinit ovat vesiliukoisia proteiineja. Integraalisten kalvoproteiinien puhdistus vaatii solukalvon häiriöitä, jotta jokin tietty proteiini voidaan eristää muista samassa kalvolokerossa olevista proteiineista. Joskus tietty kalvoveto voidaan eristää ensin, kuten eristää mitokondriot soluista ennen mitokondrion kalvossa sijaitsevan proteiinin puhdistamista.

pesuainetta, kuten natriumdodekyylisulfaattia (SDS), voidaan käyttää liuottamaan solukalvoja ja pitämään kalvoproteiineja liuoksessa puhdistuksen aikana; koska SDS aiheuttaa denaturaatiota, voidaan kuitenkin käyttää miedompia pesuaineita, kuten Triton X-100 tai CHAPS, säilyttämään proteiinin alkuperäinen konformaatio puhdistuksen aikana.

Menetelmä # 3. Ultracentrifugointi:

sentrifugointi on prosessi, jossa keskipakoisvoimalla erotetaan massaltaan tai tiheydeltään vaihtelevien hiukkasten seokset nesteeseen. Kun alusta (tyypillisesti putki tai pullo), joka sisältää proteiinien tai muiden hiukkasten, kuten bakteerisolujen seosta, pyöritetään suurilla nopeuksilla, kulmamomentti tuottaa kullekin hiukkaselle ulospäin suuntautuvan voiman, joka on verrannollinen sen massaan.

tietyn hiukkasen taipumusta liikkua nesteen läpi tämän voiman vuoksi kompensoi nesteen hiukkaseen kohdistama vastus. Sentrifugissa näytteen ”kehräämisen” nettovaikutus on, että massiiviset, pienet ja tiheät hiukkaset liikkuvat ulospäin nopeammin kuin vähemmän massiiviset hiukkaset tai hiukkaset, joiden nesteessä on enemmän ”vastusta”.

kun suspensioita ”kehrätään” sentrifugissa, astian pohjalle voi muodostua ”sakkaa”, joka rikastuu kaikkein massiivisimmille hiukkasille, joiden vastus nesteessä on vähäinen. Jäljelle jääviä, tiivistymättömiä hiukkasia, jotka jäävät suurimmaksi osaksi nesteeseen, kutsutaan ”supernatantiksi”, ja ne voidaan poistaa astiasta supernatantin erottamiseksi sakasta.

sentrifugointinopeus määritetään näytteeseen kohdistetun kulmakiihtyvyyden perusteella, joka mitataan tyypillisesti G: hen verrattuna. jos näytteitä sentrifugoidaan riittävän kauan, astian hiukkaset saavuttavat tasapainon, jossa hiukkaset kerääntyvät nimenomaan astiaan kohtaan, jossa niiden kelluva tiheys on tasapainossa keskipakoisvoiman kanssa. Tällainen” tasapainotila ” sentrifugointi voi mahdollistaa tietyn hiukkasen laajan puhdistuksen.

Sakkaroosigradientti sentrifugointi:

putkeen syntyy sokerin (tyypillisesti sakkaroosiglyseroli eli Percoll) lineaarinen pitoisuusgradientti siten, että suurin pitoisuus on pohjassa ja pienin ylhäällä. Tämän jälkeen proteiininäyte kerrostetaan gradientin päälle ja kehrätään suurilla nopeuksilla ultracentrifugissa. Tämä saa raskaat makromolekyylit vaeltamaan kohti putken pohjaa nopeammin kuin kevyempi materiaali.

sentrifugoinnin aikana sakkaroosin puuttuessa hiukkasten siirtyessä yhä kauemmas pyörimiskeskuksesta ne kokevat yhä enemmän keskipakoisvoimaa (mitä pidemmälle ne liikkuvat, sitä nopeammin ne liikkuvat). Ongelmana tässä on se, että aluksen hyödyllinen erotusalue rajoittuu pieneen havaittavaan ikkunaan.

kaksi kertaa niin pitkän näytteen pyörittäminen ei tarkoita, että kiinnostava hiukkanen menisi kaksi kertaa niin pitkälle; itse asiassa se menee huomattavasti pitemmälle. Kun proteiinit kuitenkin liikkuvat sakkaroosigradientin läpi, ne kohtaavat tiheyden ja viskositeetin kasvavan nesteen.

oikein suunniteltu sakkaroosigradientti kumoaa kasvavan keskipakoisvoiman, joten hiukkaset liikkuvat tiiviissä suhteessa aikaan, jona ne ovat olleet keskipakokentässä. Näillä kaltevuuksilla erotettuja näytteitä kutsutaan” rate zonal ” – sentrifugoinneiksi. Kun proteiini/hiukkaset on erotettu toisistaan, gradientti fraktioidaan ja kerätään.

Menetelmä # 4. Kromatografiset menetelmät:

yleensä proteiinin puhdistusprotokolla sisältää yhden tai useamman kromatografisen vaiheen. Perusmenetelmä kromatografiassa on valuttaa proteiinia sisältävä liuos kolonnin läpi, joka on pakattu eri materiaaleihin. Eri proteiinit vuorovaikuttavat eri tavoin kolonnimateriaalin kanssa, ja näin ne voidaan erottaa kolonnin läpäisyyn kuluvalla ajalla tai ehdoilla, jotka vaaditaan proteiinin eluoimiseksi kolonnista. Yleensä proteiinit havaitaan, kun ne irtoavat kolonnista absorbanssinsa perusteella 280 nm: ssä.

on olemassa monia erilaisia kromatografisia menetelmiä:

1. Koon Poissulkukromatografia:

kromatografiaa voidaan käyttää proteiinin erottamiseen liuos-tai denaturointiolosuhteissa käyttämällä huokoisia geelejä. Tätä tekniikkaa kutsutaan koon poissulkukromatografiaksi. Periaate on, että pienempien molekyylien on kuljettava suurempi tilavuus huokoisessa matriisissa. Näin ollen tietyn kokoluokan proteiinit vaativat vaihtelevan määrän eluanttia (liuotinta) ennen kuin ne kerätään geelikolonnin toiseen päähän.

proteiinipuhdistuksen yhteydessä eluantti yhdistetään yleensä eri koeputkiin. Kaikki koeputket, joissa ei ole mitattavia jälkiä puhdistettavasta proteiinista, hävitetään. Jäljelle jäävä liuos muodostuu siis puhdistavasta proteiinista ja muista samankokoisista proteiineista.

2. Ioninvaihtokromatografia:

Ioninvaihtokromatografia erottaa yhdisteet niiden ionivarauksen luonteen ja asteen mukaan. Käytettävä kolonni valitaan sen tyypin ja varauslujuuden mukaan. Anioninvaihtohartseilla on positiivinen varaus ja niitä käytetään pidättämään ja erottamaan negatiivisesti varautuneet kom-paunat, kun taas kationinvaihtohartseilla on negatiivinen varaus ja niitä käytetään erottamaan positiivisesti varautuneet molekyylit.

ennen erotuksen alkua puskuria pumpataan kolonnin läpi vastakkaisten varautuneiden ionien tasapainottamiseksi. Injektoitaessa näytettä, liuotinmolekyylit vaihtuvat puskuri-ionien kanssa, kun kukin kilpailee hartsin sitoutumispaikoista. Pituus säilyttäminen kunkin solute riippuu vahvuus sen varauksen.

heikoimmin varautuneet yhdisteet eluoituvat ensin, ja sen jälkeen ne, joilla on peräkkäin vahvemmat varaukset. Erotusmekanismin luonteen vuoksi pH: lla, puskurityypillä, puskuripitoisuudella ja lämpötilalla on kaikilla tärkeä rooli erotuksen ohjaamisessa. Ioninvaihtokromatografia on erittäin tehokas työkalu proteiinien puhdistukseen ja sitä käytetään usein sekä analyyttisissä että preparatiivisissa separaatioissa.

3. Affiniteettikromatografia:

Affiniteettikromatografia on molekyylin konformaatioon perustuva erotustekniikka, jossa käytetään usein käyttökohtaisia hartseja. Näiden hartsien pinnoille on kiinnittynyt ligandeja, jotka ovat spesifisiä erotettaville yhdisteille. Useimmiten nämä ligandit toimivat samalla tavalla kuin vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutukset. Tämä” Lukko ja avain ” sopivat ligandin ja sen kohdeyhdisteen väliin, mikä tekee siitä erittäin spesifisen, jolloin syntyy usein yksittäinen piikki, kun taas kaikki muu näytteessä on säilymätöntä.

monet kalvoproteiinit ovat glykoproteiineja ja ne voidaan puhdistaa lektiinin affiniteettikromatografialla. Pesuaineliukoisten proteiinien voidaan antaa sitoutua kromatografiahartsiin, johon on modifioitu kovalenttisesti kiinnittynyt lektiini.

proteiinit, jotka eivät sitoudu lektiiniin, pestään pois, minkä jälkeen erityisesti sitoutuneet glykoproteiinit voidaan eluoida lisäämällä lektiinin sitoutumiskohdassa sitoutuneiden glykoproteiinien kanssa kilpaileva suuri sokeripitoisuus. Joillakin lektiineillä on suuri affiniteetti sitoutuessaan glykoproteiinien oligosakkarideihin, joiden on vaikea kilpailla sokereiden kanssa, ja sitoutuneita glykoproteiineja on vapautettava denaturoimalla lektiini.

4. Metallien Sitominen:

yleisessä tekniikassa 6-8 histidiinin sarja tehdään proteiinin C-terminaaliin. Polyhistidiini sitoutuu voimakkaasti kaksiarvoisiin metalli-ioneihin kuten nikkeliin ja kobolttiin. Proteiini voi kulkeutua immobilisoituneita nikkeli-ioneja sisältävän kolonnin läpi, joka sitoo polyhistidiinilappua. Kaikki puhdistamattomat proteiinit kulkevat kolonnin läpi.

proteiini voidaan eluoida imidatsolilla, joka kilpailee polyhistidiini-tagin kanssa sitoutumisesta kolonniin, tai pH: n laskulla (tyypillisesti 4,5: een), joka vähentää tagin affiniteettia hartsiin. Vaikka tätä menetelmää käytetään yleensä rekombinanttien proteiinien puhdistamiseen suunnitellulla affiniteettitunnisteella (kuten 6xhis-tunnisteella tai Kloonitechin HATTUTUNNISTEELLA), sitä voidaan käyttää myös luonnollisille proteiineille, joilla on luontainen affiniteetti tor-divalenttikationeilla.

5. Immunoaffiniteettikromatografia:

Immunoaffiniteettikromatografiassa käytetään vasta-aineen spesifistä sitoutumista kohdeproteiiniin proteiinin selektiiviseen puhdistamiseen. Toimenpiteeseen kuuluu vasta-aineen immobilisointi kolonnimateriaalille, joka sitten sitoo valikoivasti proteiinia, kun taas kaikki muu virtaa läpi. Proteiini voi Ix eluoitua muuttamalla pH: ta tai suolapitoisuutta. Koska tähän menetelmään ei liity merkintää, sitä voidaan käyttää luonnollisista lähteistä peräisin oleviin proteiineihin.

6. HPLC:

korkean erotuskyvyn nestekromatografia tai korkeapaineinen nestekromatografia on kromatografian muoto, jossa käytetään korkeaa painetta liuottimien ajamiseksi kolonnin läpi nopeammin. Tämä tarkoittaa, että diffuusio on rajallinen ja resoluutio on parantunut. Yleisin muoto on” käänteisfaasi ” HPLC, jossa kolonnimateriaali on hydrofobinen.

proteiinit eluoidaan gradientilla, jossa on yhä enemmän orgaanista liuotinta, kuten asetonitriiliä. Proteiinit eluoituvat hydrofobisuutensa mukaan. HPLC: n puhdistuksen jälkeen proteiini on liuoksessa, joka sisältää vain haihtuvia yhdisteitä ja voidaan helposti kylmäkuivata. HPLC-puhdistus johtaa usein puhdistettujen proteiinien denaturoitumiseen, joten sitä ei voida soveltaa proteiineihin, jotka eivät palaudu itsestään.