Mitoydinintrogressiolinjojen rakentaminen
mtDNA: n geneettisten vaikutusten eristämiseksi ydingeenistä, kokeemme perustuivat mitonukleaarisiin introgressiolinjoihin (MNILs). Rakentaminen meidän MNILs selitetään yksityiskohtaisesti Kurbalija Novicic et al. . Lyhyesti sanottuna kaikki käytetyt Mnilit luotiin isofemale linjoista (IFLs), joista jokaisen perusti yksi luonnonvaraisena kerätty pariutunut naaras, joka on peräisin yhteisestä luonnollisesta populaatiosta (Sicevon Rotko-Serbia, S 43°19’55.58″ N 22°0837.98″). Linjat oli ensin genotyypin niiden mtDNA haplotyyppi käyttäen restriktioentsyymien ja valitsimme kuusi IFL, joista kolme kantoi HI haplotyyppejä ja kolme HII haplotyyppejä, joista jokainen oli sitten backcrossed yhteinen seitsemäs IFL (”D”). Jokaisessa MNIL: ssä backcrossing suoritettiin parittamalla 10 neitsyttä naarasta tietystä IFL: stä ja 20 urosta d-linjasta. Käytimme tätä toistuvaa introgressiivistä backcrossing-menetelmää 12 seuraavan sukupolven ajan korvataksemme tietyn IFL: n ydingeenit yhteisellä outbred d-ydingenomilla (> 99,95% korvattu). Huomaa, että IFL: ää ei ole sisäsiitetty tai muuten tehty isogeeniseksi. Jotta vältettäisiin kontaminaation mahdollisuus introgression aikana, kaikkien Mnil: ien mtDNA-eheys validoitiin sukupolvessa 5, 8 ja 12 genotyypittämällä jokaisesta MNIL: stä kärpäsnäyte. Seuloimme myös wolbachian esiintymisen kaikissa MNILs: issä PCR-määrityksellä käyttäen 16s rDNA Wolbachia-spesifisiä alukkeita García-Martínez et al. . Käytimme kahta eri Wolbachia sisältävää Drosophila-kantaa positiivisina kontrolleina (D. melanogaster stock no. 5, Bloomington Stock Centre, D. simulans, Riverside strain). Nämä PCR-määritykset olivat negatiivisia kaikkien Mnil: ien ja D-linjan osalta. Kaikki linjat säilytettiin ja kaikki kokeet tehtiin jatkuvissa laboratorio-olosuhteissa, 19 °C: ssa, 60%: n suhteellisessa kosteudessa, 300 lx: n valossa ja 12 h: n valokopiossa: 12 h pimeässä.
kokeellisen evoluution populaatioiden perustaminen
ennen kokeita yhdistimme kolme Hi: tä kantavaa Mnil: iä yhdeksi HI: n lähdepopulaatioksi ja kolme HI: n Mnil: iä HI: n lähdepopulaatioksi homogenisoidaksemme potentiaalisen ydingeenisen variaation Mnil: ien välillä. Tämä tehtiin sekoittamalla 100 aikuista kärpästä kustakin MNIL: stä kahteen populaatiohäkkiin (ts., N = 3 × 100 kärpästä häkissä) (Plexiglas-häkit, L25 cm x W15 cm xH15 cm, 3 ruokalajia, joista jokainen sisältää 30 ml maissijauhoa) ja näiden säilyttäminen yhden seuraavan kokonaisen sukupolven ajan standardilaboratorio-olosuhteissa. Kaksi lähdepopulaatiota kantoivat siis joko HI-tai HII mtDNA-haplotyyppiä, joka ilmaistaan ulkosiittoisena ja yhteisenä ydingeenitaustana (eli D). Näiden kahden lähdepopulaation neitsytkärpäset sitten sukupuolitettiin ja käytettiin kokeellisen evoluution populaatioiden löytämiseen.
aloitimme n = 12 kokeellisen evoluution populaatiota. Kussakin populaatiossa lähdepopulaatioista tuotiin n = 100 3-5 päivän ikäistä neitseellistä kärpästä (sukupuolisuhde 1:1) populaatiohäkkiin (L25 cm x W15 cm xH15 cm). Vaihdoimme HI-ja HII-haplotyyppien ja ravintoresurssien lähtötaajuutta populaatioissa käyttäen 2 × 2 risteytettyä rakennetta (N = 3 populaatiota solua kohti) seuraavalla tavalla. Puolessa häkeistä 80% oli Hi-lähdepopulaatiosta ja 20% Hi-lähdepopulaatiosta. Toisella puoliskolla 20% perustajakärpäsistä kuului HI-lähdepopulaatioon ja 80% Hi-lähdepopulaatioon. Ravintoresurssien osalta väliaineen määrä (sekä tilavuutena että pinta-Alana) oli sama kahdessa käsittelyryhmässä, kun taas populaation sisällä ravinnepitoisuuden vaihtelua manipuloitiin seuraavasti. Puolet häkeistä (homogeeniset ravinto-olosuhteet) sisälsi 3 samanlaista ruoka-ainetta, joista jokaisessa oli 30 ml tavallista maissijauhoainetta (YC), joka sisälsi 1,5% hiivaa. Häkkien toinen puolisko (heterogeeniset ravinto-olosuhteet) sisälsi myös 3 ruokalajia, joissa kussakin oli 30 ml vakioliuosta, mutta nämä erosivat hiivapitoisuuksissa (YL-0,375%, YC – 1,5%, YH – 6%).
kokeellisen evoluution populaatioiden
populaatiot säilyivät laboratoriossa siten, että varmistettiin erilliset sukupolvet , 40 päivää/sykli, 19 °C: ssa, 60%: n suhteellinen kosteus ja 12 tunnin valo: 12 tunnin pimeä sykli. Päivänä 40 kolme vanhaa ruoka-annosta korvattiin kolmella uudella ja kärpäset saivat olla ovipositiossa yhteensä 9 päivää . Uudet astiat, jotka sisälsivät munia ja toukkia, raivattiin aikuisilta ja siirrettiin uuteen häkkiin seuraavan sukupolven aloittamiseksi. Jokaisen vanhan häkin kaikki aikuiset kärpäset laskettiin sitten, kun ne olivat kuolleet.
sekvensointi-ja mitogenomikokoonpanot
ennen haplotyyppien taajuuden estimointia (KS.alla) sekvensoimme ja kokosimme kaikki käytetyt mtDNA: n haplotyypit. DNA erotettiin Mnilien luomiseen käytetyistä kuudesta IF-linjasta (HI: 1, 3, 5; HII: 21, 25, 29) suola-etanoli-saostusprotokollan avulla. Kärpäset maseroitiin ensin varovasti ja laitettiin valmistepuskuriin (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH = 8, 0, 0% SDS) yhdessä proteinaasi K: n kanssa, pyörteitettiin ja inkuboitiin 50 °C: ssa yön yli. Tämän jälkeen näytteet jäädytettiin yön yli. DNA: n saostamiseksi lisäsimme kyllästettyä NaCl: ää useita kertoja ennen 95-prosenttisen etanolin lisäämistä ja pyöritimme DNA: n pelletiksi. DNA-pelletti suspendoitiin TE 4-puskuriin (pH = 7,6). DNA: n laatu ja määrä arvioitiin Nanodropin, Qubitin ja Bioanalysaattorin avulla, minkä jälkeen fragmenttien pituus arvioitiin agaroosigeelillä.
Sekvensoivat kirjastot valmistettiin 100 ng DNA: sta käyttäen TruSeq PCRfree DNA library preparation kit-pakettia. Kuusi näytettä sekvensoitiin sitten 125 bp: n pariloppuisiin lukemiin kahdella kaistalla Illumina HiSeq2500-järjestelmässä käyttäen v4-sekvensointikemiaa. Yhteensä jaksotimme keskimäärin 194 miljoonaa lukua jokaista kirjastoa kohti. Kuuden näytteen mitogenomit koottiin sitten käyttäen 5%: n osajoukkoa kunkin kirjaston lukemien kokonaismäärästä. Lukemat syötettiin MITObim V 1.8-algoritmille ja MIRA v 4.0-algoritmille.2 assembler, suorittaa ohjattuja kokoonpanoja, käyttäen Drosophila pseudoobscura mitogenome (GenBank: FJ899745.1) referenssigenomi. Kaikki saadut kokoonpanot olivat pyöreitä mitogenomeja, joiden koko oli lähes 16kbp. Lopulliset kokoonpanot linjattiin sitten ClustalW: n ja MAFFT: n avulla ja käsin kuratoitiin lopullisen kiillotetun kokoonpanon saamiseksi kullekin haplotyypille. Kootut mitogenomit merkittiin DOGMILLA ja mitoilla, käyttäen oletusparametriasetuksia ja lopuksi käsin kuratoitiin.
mitogenomikokoonpanomme pätevyyden arvioimiseksi kaikki Genbankissa saatavilla olevat Drosophila subobscura mtDNA-sekvenssit (Cox1, Cox2, Cox3, Cob, Nad1, Nad2, Nad3, Nad5, Rrnl, rrnS, a + t rikas alue ja useat trna), yhteensä yli 50% koko kokoonpanosta, olivat linjassa mitogenomiemme kanssa. Poikkeuksetta nämä osoittivat > 99% sekvenssin identiteetin.
jokaisesta kuudesta mitogenomi-haplotyypistä (KS.alla) löydettiin useita ainutlaatuisia SNP: itä, joista kaksi erotti johdonmukaisesti HI-ja HII-haplotyyppiryhmät. Kunkin SNP: n peittosyvyys tarkistettiin kartoittamalla mitogenome-kokoonpanossa käytetyt lukemat Bowtie v 1.2: n avulla . Nämä toimet vahvistivat kaikki kokoonpanovaiheessa yksilöidyt kansalliset turvallisuusviranomaiset. Tässä keskitymme kahteen pääasialliseen haplotyyppiryhmään I ja II, jotka osoittavat silmiinpistävää ja johdonmukaista mallia populaation sisällä olevasta polymorfismista eri populaatioissa (Kuva. 1) ja funktionaaliset fenotyyppiset erot (KS.Johdanto). Vaikka SNP: t esiintyvät kummassakin haplotyyppiryhmässä, tällaiset SNP: t ovat harvinaisia (esim.) eivätkä ole johdonmukaisesti polymorfisia.
mtDNA: n haplotyypin taajuuksien estimointi
käytimme pool-seq: ta arvioidaksemme haplotyypin taajuuskehitystä sekvensoimalla kunkin kokeellisen evoluutiopopulaation 5.ja 10. sukupolven kärpäsnäytteitä. Kussakin näytteessä yhdistettiin 105 satunnaisesti valittua kärpästä häkkiä kohti ja niistä otettiin DNA-uutto (15 hengen ryhmissä) ja sekvensoitiin kirjastovalmistelut edellä kuvatulla tavalla. N = 24-näytteet sekvensoitiin sitten 125 bp: n pariloppuisiin lukemiin kahdella kaistalla Illumina HiSeq2500-järjestelmässä käyttäen v4-sekvensointikemiaa. Pool-seq-pyrkimyksemme oli suunniteltu tarjoamaan riittävä sekvensointisyvyys mtDNA: n haplotyyppitaajuuksien tarkkaan arviointiin, mutta se ei salli yksityiskohtaisia analyysejä ydinperimästä.
jaksotimme keskimäärin 66 miljoonaa lukua jokaista kirjastoa kohti. Lukemat jokaisesta kirjastosta kartoitettiin sitten takaisin kuuteen koottuun mitogenomiin, säilyttäen vain ainutlaatuiset ja nolla-Epäsuhtaiset kuvaukset käyttäen Bowtie v 1.2: ta . Kahden SNP: n lukukartoituksen määrä, joka erotti HI-ja HII-tyypit (Nad5: ssä ja 12S rRNA: ssa), laskettiin sitten ja käytettiin arviona kunkin Pää-haplotyypin (HI tai HII) suhteellisesta esiintymistiheydestä kussakin näytteessä.
tilastolliset analyysit
kunkin näytteen osalta kaikki lukukartoitukset kahteen diagnostiseen SNP: hen (KS.jäljempänä) laskettiin joko tyypin HI tai tyypin HII mukaisiksi. HI-lukujen osuus kahdesta eri kansallisesta viitearvosta korreloi hyvin läheisesti 24 näytteen välillä (r = 0,987), joten molemmat merkit antoivat lähes identtiset arviot. Tässä käytimme molempien SNP: iden keskiarvoa arvioidaksemme HI: n esiintymistiheyttä kussakin poolissa-seq-näytteessä.
evoluutio voidaan määritellä genotyypin frekvenssien muutoksiksi populaation sisällä, ja rakenteemme ansiosta pystyimme johtamaan kaksi ajallisesti erotettua toistuvaa mittausta sukupolvea kohti haplotyypin frekvenssimuutoksia kullakin kehittyvällä suoralla joko Δf0–5 = (f5 – f0)/5 tai Δf5–10 = (f10 – f5)/5, jossa alaindeksit tarkoittavat sukupolvea, jolla näyte kerättiin. Lisäksi arvioimme Δf0–10 = (f10 – f0)/10 arvioidaksemme haplotyypin taajuuden muutosta. Koska kyseessä oli vain kaksi genotyyppiä, hi: fI = 1 – fII: n frekvenssi, ja näin rajoitamme analyysimme yhden haplotyypin frekvenssin muutoksiin. Jokaista Δf-estimaattia varten johdimme myös taajuudesta riippuvan valintakertoimen (SI), joka vastaa valinnan voimakkuutta, joka tarvitaan haplotyyppitaajuuksien havaitun muutoksen aiheuttamiseen (KS.alla).
jokainen kehittyvä linja edustaa havaintoyksikköä suunnittelussamme, ja Siksi analysoimme dataamme toistuvilla mittauksilla anovas (eli in-subjects ANOVAs). Tässä jokainen rivi edustaa subjektia, ja ALOITUSTIHEYS HI (0,2 tai 0,8) ja ympäristön tila (homogeeninen tai heterogeeninen) olivat kaksi subjektien välistä tekijää, ja kaksi toistuvaa mittausta (Δf tai SI), jotka tehtiin eri sukupolvien välein, käsiteltiin subjektien sisäisenä tekijänä. Näissä analyyseissä koehenkilöiden väliset tekijät testaavat kokeellisten hoitojemme vaikutuksia ja koehenkilöiden sisäiset tekijät testaavat, muuttuiko evoluution malli kokeemme aikana. Tämä analyyttinen strategia perustuu siihen, että seuraamme taajuusdynamiikkaa toistetuilla ja itsenäisillä radoilla, ja satunnaisen geneettisen ajautumisen ei-fokaalinen vaikutus, jonka ennustetaan olevan merkittävä mtDNA: n dynamiikalle, muodostaa osan pääteltyjen malliemme jäännöstermistä. Koehenkilöiden välisten tekijöiden perinteiset F-testit validoitiin permutaatiotesteillä, jotka perustuivat 9999 satunnaiseen permutaatioon. Eri ryhmien keskimääräiset SI-arvot arvioitiin käyttäen 95%: n luottamusväliä 9999 bootstrap-monisteesta saaduista tiedoista.
arviot taajuusriippuvaisen valinnan voimakkuudesta
halusimme myös tarkemmin arvioida, poikkesivatko taajuusriippuvaisen valinnan voimakkuus HI-ja HII-yhdisteissä kahden kokeellisen ympäristökäsittelyn (homogeeninen / heterogeeninen) välillä. Tämän mahdollistamiseksi johdimme empiirisestä aineistostamme yksinkertaisia taajuudesta riippuvan valinnan mittareita käyttäen seuraavia perusteluja. Aikaisempi eksplisiittinen mallintaminen ei-kokeellisista tiedoista tässä järjestelmässä on osoittanut, että parhaiten sopii haplotyyppien taajuusdynaamiseen dataan, jos näissä mtDNA-haplotyypeissä ei ole positiivista tai negatiivista valikoimaa, mutta jos on negatiivinen taajuusriippuvainen valinta, joka on yhtä voimakas molemmissa haplotyypeissä . Harkitsemme kahta mtDNA haplotyyppiä HI ja HII, joiden taajuudet ovat pI ja pII (pI + pII = 1) sekä fitnesses WI ja WII. Piin sukupolvenvaihdos saadaan tämän jälkeen
$$ \Delta {p}_I=\frac{p_I{p}_{II}\left ({W}_I-{W}_{II}\right)}{\overline{W}} $$
havaintoja molemmista luonnonpopulaatioista (KS. 1; Lisätiedosto 1) ja monistetut laboratoriohäkkipopulaatiot viittaavat myös siihen, että valinta on symmetrinen kahden haplotyypin HI ja HII tasapainon kanssa PI: n läheisyydessä = pII = 0,5. Olettaen, että I) tasapainotaajuus on PI = pII = 0.5, (ii) että haplotype fitness on lineaarisesti yhteydessä haplotype taajuus ja (iii) että valinta on symmetrinen, jotka kaikki tukevat aiemmat tutkimukset, saavutamme
$$ {W}_I=1 – {p}_i{s}_I $$
$$ {W}_{II}=1 – {p} _ {II}{s}_I $$
jossa sI on taajuudesta riippuva valintakerroin. Koska \ (\overline{W}={P}_I{W}_i + {p} _ {II}{w} _ {II} \) voimme arvioida si: n empiiristen havaintojemme perusteella ΔpI: ksi
$$ {s}_i=\frac {- \Delta {p}_I{p}_I{II}} {- \Delta {p} _I {P}_{II}} {- \Delta {p} _I {P_ {II}}^2 – {p_I{p} _ {II}}^2+{p_i}^2{p_i} _ {II} – \Delta {p}_I{p_i {p_I} _ }^2} $$
näin määriteltynä sI olettaa mielivaltaisen asteikon, mutta on positiivinen, kun ΔpI muuttuu attraktoria kohti ja negatiivinen, kun se muuttuu pois attraktorista. Jokaista häkkiä kohti arvioimme kaksi riippumatonta toistuvaa si-mittaa, jotka perustuvat havaittuihin haplotyyppien taajuusmuutoksiin sukupolvien 0-5 ja 5-10 välillä. Huomaamme, että mittamme on tarkka, kun todellinen tasapaino on lähellä pI = pII = 0,5, mutta likimääräisempi, jos todellinen tasapaino poikkeaa tästä ehdosta.
