Abstrakti
influenssavirus neuraminidaasilla (NA) on keskeinen rooli jälkeläisten virioiden vapautumisessa ja leviämisessä solunsisäisen viruksen replikaatiosyklin jälkeen. Testataksemme, voisiko NA helpottaa myös viruksen pääsyä soluun, tartutimme ihmisen hengitysteiden epiteeliviljelmiä ihmis-ja lintuinfluenssaviruksilla NA-inhibiittorin oseltamiviirikarboksylaatin läsnä ollessa. 20-500 kertaa vähemmän soluja infektoitui lääkehoidossa kuin ei-hoidetuissa viljelmissä (P < 0, 0001) 7 tuntia viruksen levittämisen jälkeen, mikä viittaa siihen, että lääke esti infektion alkamisen. Nämä tiedot osoittavat, että virusperäisellä NA: lla on merkitystä infektion varhaisessa vaiheessa, ja ne antavat lisäperusteita NA: n estäjien profylaktiselle käytölle.
uskotaan, että viruksen neuraminidaasin (NA) pääasiallinen tehtävä on infektion loppuvaiheessa, kun NA pilkkoo siaalihappoa solun pinnalta ja jälkeläisten virioneita, jotka helpottavat viruksen vapautumista infektoiduista soluista (1, 2). NA: n toiminnoista viruksen soluun saapumisen aikana tiedetään vähemmän. On jo pitkään oletettu, että NA edistää viruksen pääsyä kohdesoluihin hengitysteissä liman hajoamisen kautta (3). Tätä käsitettä ei kuitenkaan ole koskaan virallisesti todistettu, koska riittävää kokeellista järjestelmää ei ole. Lisäksi on raportoitu joitakin todisteita, joiden perusteella NA: n rooli infektion alkuvaiheessa on kiistetty (tarkasteltu viite 2: ssa).
tämän ongelman ratkaisemiseksi tutkimme NA-estäjän oseltamiviirikarboksylaatin (oc) (9) vaikutuksia influenssaviruksen pääsyyn ihmisen hengitysteiden epiteelin viljelmiin. Primääriset ihmisen trakeobronkiaaliset epiteelisolut (HTBE; Clonetics) ja primääriset nenän epiteelisolut (PromoCell GmbH) kasvatettiin kalvotukilla (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) ilman ja nesteen rajapinnassa seerumittomassa kasvutekijässä ja hormoneilla täydennetyssä väliaineessa (6, 8). Kaikissa kokeissa käytettiin täysin eriytyneitä 4-8 viikon ikäisiä kulttuureja. Nämä viljelmät olivat pseudostratifioitu ja polarisoitunut; sisälsi basal, ciliated, ja limaa erittävät solut; ja muistutti läheisesti ihmisen hengitysteiden epiteelin in vivo (Kuva. 1). OC (1 µM, ellei toisin mainita) lisättiin virussuspensioihin ja viljelmien basolateraalisiin lokeroihin vähän ennen kuin tartutettiin kaksi rinnakkaisviljelmää apikaaliselta puolelta. Kaksi kontrolliviljelmää sai tartunnan estäjän puuttuessa. Tunnin kuluttua tartunnasta poistimme viruksen inokulaatin ja inkuboimme ilman ja nesteen rajapinnassa vielä 6 tunnin ajan, jotta virus replikoituisi solunsisäisesti. Viljelmät vahvistettiin, ja infektoituneet solut tunnistettiin värjäämällä polyklonaalisilla antiseerumeilla kokonaisia viruksia vastaan, joita seurasivat vastaavat peroksidaasi-merkityt sekundaariset vasta-aineet (Dianova) ja aminoetyylikarbatsolisubstraatti (Sigma). Positiivinen värjäytyminen osoitti viruksen onnistuneen pääsyn soluun. Kulttuurit analysoitiin en face suurennoksella ×300 (Olympus IMT-2). Virusantigeenia ilmentävien solujen kokonaismäärä laskettiin epiteelisegmenttiin, joka sisälsi kaikki peräkkäiset mikroskooppikuvat (0,28 X 0,42 mm) viljelmän halkaisijan (segmentin pinta-ala 3 mm2; solujen lukumäärä segmenttiä kohti, noin 30 000). Neljä lohkoa viljelyä kohti laskettiin kiertämällä viljelmää myötäpäivään 45o: lla. kahden toisinnetun viljelmän kahdeksan segmentin tiedot laskettiin keskiarvona.
kahdessa kokeessa, joissa käytettiin HTBE – viljelmiä, ihmisvirus a/Memphis/14/96 (H1N1) infektoi 22-ja 65-kertaisesti vähemmän soluja NA-estäjän läsnä ollessa verrattuna kontrolleihin (Kuva. 2; Taulukko 1) (P < 0, 0001). Myös luonnonvaraisesta vesilinnusta peräisin olevat virukset A/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) ja kotieläiminä pidettävästä siipikarjasta peräisin olevat virukset A/Turkey/Italy/2379/99 (H7N1) olivat näissä viljelmissä huomattavan herkkiä OC: lle. Nenän epiteeliviljelmissä OC vähensi ihmisen virustartunnan 120 – kertaiseksi ja ankkavirustartunnan 520-kertaiseksi. Nämä tulokset viittasivat siihen, että virusperäisen NA: n esto estää virusinfektion alkamista.
A/Chicken/Germany/R28 / 03 (H7N7) kuuluu korkeapatogeenisen lintuinfluenssaviruksen sukuun, joka aiheutti kanaruton taudinpurkauksen kaupallisilla siipikarjatiloilla Alankomaissa, Belgiassa ja Saksassa vuonna 2003. Nämä virukset tarttuivat ainakin 89 ihmiseen, joista useimmilla oli sidekalvotulehdus, mutta myös yksi kuolemaan johtanut keuhkokuumetapaus (5). H7N7-kanavirustartunta väheni HTBE-viljelmissä 140 – kertaiseksi ja 0, 1 µM OC: n läsnä ollessa 40-kertaiseksi. Nämä pitoisuudet edustivat tyypillisiä lääkeaineen enimmäis – ja vähimmäispitoisuuksia plasmassa, kun ihmisille annettiin 75 mg oseltamiviirifosfaattia, joka on suositeltu annos ennaltaehkäisyyn (9).
vahvistaaksemme hypoteesin, että infektion esto kokeissamme liittyi suoraan viruksen na-entsymaattisen aktiivisuuden estoon, käytimme ihmisen a / Sydneyä/5/97-kuten virus (H3N2) ja sen oseltamiviirille resistentti mutantti, joilla on R292K-substituutio NA: ssa, jolloin NA on 9000 kertaa vähemmän herkkä OC: n estolle (4). Hypoteesin mukaisesti OC inhiboi voimakkaasti ihmisen kantavirusta, kun taas resistentin mutantin inhibitio havaittiin vain marginaalisella tasolla, kun molempia viruksia testattiin samassa kokeessa HTBE-viljelmillä (Taulukko 1). Tähän mennessä ei ole ollut saatavilla riittävää soluviljelmämääritystä influenssaviruksen resistenssin seuraamiseksi NA-estäjille, koska sialihapporeseptorit ovat epäsuhtaisia ihmisillä ja tavanomaisissa laboratoriosolulinjoissa (9, 11). Tuloksemme viittaavat siihen, että ihmisen hengitysteiden epiteelin eriytyneet viljelmät voivat olla sopiva soluviljelyjärjestelmä influenssaviruksen vastustuskyvyn toteamiseen NA-estäjille.
lopulta huumeherkän a / Sydneyn avulla/5/97-kuten virus, testasimme tartuntojen estoa OC: lla, joka on lisätty eri aikoina virusrokotuksen jälkeen. Kun 47-kertainen määrä soluja sai tartunnan, kun lääke lisättiin vähän ennen tartuntaa, 1-h: n viive OC: n lisäksi johti vain 1, 5-kertaiseen inhibitioon verrattuna ei-hoidettuun kontrolliin (Taulukko 1). Jos lääke lisättiin 4 h viruksen inokulaation jälkeen, tilastollisesti merkitsevää inhibitiota ei havaittu. Nämä tiedot viittasivat siihen, että OC vaikutti viruksen replikaatiota edeltävän infektion varhaisimpiin vaiheisiin.
yhteenvetona, olemme esittäneet tässä ensimmäistä kertaa suoraa kokeellista näyttöä NA: n keskeisestä roolista viruksen invaasion vaiheessa ihmisen hengitysteiden värekarvaisessa epiteelissä. NA-toiminto tässä vaiheessa on todennäköisesti poistaminen houkutusreseptorien mucins, värekarvojen, ja solujen glykokalix, vahva sitoutuminen jokaiseen, joka estäisi viruksen pääsyä toiminnallisia reseptoreita pinnan kalvo kohdesolujen. Muita NA: n toimintoja—esimerkiksi hemagglutiniinivälitteisen fuusion edistämistä (7)-ei voida kuitenkaan sulkea pois, ja lisätutkimuksia tarvitaan tarkempien mekanismien määrittämiseksi, joilla NA edistää viruksen pääsyä hengitysteiden epiteelisoluihin.
koska erittäin patogeenisiä h7n7-ja H5N1-lintuinfluenssaviruksia vastaan ei ole vielä rokotetta, viruslääkkeet ovat edelleen ainoa vaihtoehto lintuinfluenssan torjumiseksi (10). Muihin influenssalääkkeisiin verrattuna NA-estäjät ovat hyvin siedettyjä ja tehokkaita kaikkia influenssa A-ja B-viruskantoja vastaan. Virusresistenssin synnystä on ollut vain vähän näyttöä, ja mutanttivirusten infektiivisyys on yleensä vaarantunut (9, 11). NA-estäjien kyky tukahduttaa infektio ennen viruksen pääsyä soluihin korostaa niiden suurta potentiaalia ennalta ehkäiseviin toimenpiteisiin. Tietomme tarjoavat tieteellisen perustan näiden yhdisteiden ennaltaehkäisevälle käytölle henkilöille, joilla on suuri riski saada lintuinfluenssavirustartunta.
