lyhyt esittely: Blottausmenetelmiä
blottausta käytetään molekyylibiologiassa proteiinien ja nukleiinihappojen tunnistamiseen ja sitä käytetään laajalti diagnostisiin tarkoituksiin. Tämä tekniikka lamauttaa kiinnostavan molekyylin kannalle, joka on nitroselluloosainen kalvo tai nailon. Se käyttää hybridisaatiotekniikoita spesifisten nukleiinihappojen ja geenien tunnistamiseen.
blottaustekniikka on työkalu, jota käytetään biomolekyylien kuten ad-DNA: n, mRNA: n ja proteiinin tunnistamiseen geenien eri ilmentymisvaiheissa. Proteiinisynteesiin liittyy ilmentymistä DNA-segmentin, joka saa muunnetaan mRNA tuottaa vastaavan proteiinin.
blottauksen alatyypit kuten Pohjoinen, läntinen & eteläinen riippuvat tavoiteltavasta kohdemolekyylistä. Kun DNA-sekvenssi on proteiinimolekyylin perusta tai koodi, kyseinen kiinnostava DNA-molekyyli voidaan blottata eteläisellä Blottaustekniikalla. Geeniekspression aikana, kun DNA ilmaistaan mRNA: na proteiinin tuotannossa, tämä prosessi voidaan tunnistaa pohjoisella blottauksella. Lopuksi koodattu mRNA tuottaa kyseisen proteiinin, tämä proteiinin tunnistaminen voidaan tehdä Western Blotting.
yleinen blottaus
- näyte homogenoidaan.
- tärkeä molekyyli erotetaan elektroforeesikalvolla.
- molekyylien siirtäminen nitroselluloosakalvolle / nailonkalvolle.
- molekyylin hybridisaatio tai tunnistaminen
Northern Blotting
Northern Blotting on menetelmä, jota käytetään geenin ilmentymisen tutkimiseen. Se tapahtuu havaitsemalla tiettyä RNA: ta (tai eristettyä mRNA: ta). mRNA: n osuus KOKONAISRNA-sekvenssistä on yleensä 5%. Tämä menetelmä paljastaa identiteetti, määrä, toiminta, ja koko tietyn geenin. Tätä blottaustekniikkaa voidaan käyttää myös kudoksen tai eliön kasvuun. Erilaistumisen ja morfogeneesin eri vaiheissa RNA: n runsaus muuttuu ja tämä voidaan tunnistaa tämän tekniikan avulla. Se auttaa myös tunnistamaan epänormaali, sairas tai tartunnan tila molekyylitasolla. Northern blot-tekniikan kehittivät vuonna 1977 James Alwine, David Kemp ja George Stank Stanfordin yliopistossa. Tekniikka sai nimensä johtuen prosessin samankaltaisuudesta Southern blottingin kanssa. Ensisijainen ero näiden kahden tekniikan välillä on se, että pohjoinen blottaus koskee vain RNA: ta.
periaate
kuten kaikki normaali blottaustekniikka, Pohjoinen blottaus aloitetaan elektroforeesilla, jossa RNA-näytteet erotetaan koon mukaan. Elektroforeesi erottaa RNA-molekyylit nukleiinihappojen varauksen perusteella. Nukleiinihappojen varaus on verrannollinen nukleiinihapposekvenssin kokoon. Näin elektroforeesikalvo erottaa Nukleiinihapposekvenssin RNA-sekvenssin koon mukaan. Jos kohdesekvenssimme on mRNA, näyte voidaan eristää oligoselluloosakromatografisilla tekniikoilla, kuten mRNA: lle on ominaista poly (A) – pyrstö. Koska geelimolekyylit ovat luonteeltaan hauraita, erotetut sekvenssit siirtyvät nailonkalvoihin. Nailonkalvon valinta vaikuttaa siihen, että nukleiinihapot ovat negatiivisesti varautuneita luonnossa. Kun RNA-molekyylit ovat siirtyneet, se immobilisoituu kovalenttisella sidoksella. Koetin lisätään sitten, koetin voi olla täydentävä SS DNA sekvenssi. Formamidia käytetään yleensä blottauspuskurina, koska se alentaa hehkutuslämpötilaa.
menettely
- kerätty kudos-tai viljelynäyte homogenoidaan ensin. Näytteet voivat olla vertailtavia eri viljelmätyyppejä edustavia tai niitä voidaan käyttää viljelmän eri kasvuvaiheiden tutkimiseen.
- RNA-sekvenssi erotetaan elektroforeesiyksikössä nukleiinihappoerotukseen käytetään agaroosigeeliä.
- nyt erotettu RNA-sekvenssi siirtyy nailonkalvolle. Tämä tapahtuu kahden mekanismin kapillaarivaikutuksella ja ionisella vuorovaikutuksella.
- siirto-operaatio tehdään pitämällä geeli seuraavassa järjestyksessä. Ensin pinon pohjalle asetetaan agaroosigeeli, jota seuraa blottauskalvo. Näiden talouspaperin päälle asetetaan mieto paino (lasilevy). Koko setup pidetään dekantterilasiin, joka sisältää siirtopuskurin.
- nailonkalvolle siirretty RNA kiinnitetään UV-säteilyn avulla.
- kiinteä nailonkalvo sekoitetaan sitten antureihin. Luotaimet on suunniteltu erityisesti kiinnostuksen kohteena olevaa geeniä varten niin, että ne hybridisoituvat RNA-sekvenssien kanssa kiinnostuksen tapahtumasarjaa vastaavassa blotissa.
- läikkäkalvo pestään, jotta ei-toivottu koetin
- merkitty koetin havaitaan kemiluminesenssilla tai autoradiografialla. Tuloksena on tummat nauhat röntgenfilmissä.
geeli ja koettimet
RNA-näytteet erotellaan agaroosigeeleillä käyttäen denaturointiaineena formaldehydiä, mutta pienissä RNA-tai mikro-RNA-sekvensseissä voidaan käyttää myös polyakryyliamidisekvenssejä, joissa on ureaa denaturointiaineena. Etidiumbromidia voidaan käyttää värjäysaineena. Kokomerkintää varten on kahdenlaisia merkkejä. RNA-sekvenssien koon tunnistamiseen käytetään RNA-tikkaita ja ribosomaalista alayksikköä.
luotaimet voivat täydentää koko RNA: ta tai sen osaa. Ne voivat olla RNA: ta, DNA: ta tai oligonukleotideja, joissa on 25 kohde-RNA: ta komplementaarista baseparia. RNA-koettimissa käytetään invitron tuottamia koettimia, sillä invivo-koettimet voivat denaturoitua tiukan pesun vuoksi. CDNA: n tapauksessa luotaimet merkitään radioaktiivisilla isotoopeilla, emäksisellä fosfataasilla tai piparjuuriperoksidaasilla kemiluminesenssin tapauksessa.
