onkologian raportit

Johdanto

vaikka uudenlaisia hoitoja on äskettäin otettu kliiniseen käytäntöön kehittyneen prostaattisyövän hoidossa, eturauhassyöpä on pysynyt miesten toiseksi kuolleimpana syöpänä Yhdysvalloissa vuonna 2014 (1). Uusia hoitotavoitteita ja-strategioita tarvitaan kiireesti eturauhassyöpää sairastavien potilaiden kliinisen hoitotuloksen parantamiseksi entisestään.

yksi lupaava mahdollinen terapeuttinen kohde on sykliinistä riippuvainen kinaasi 5 (CDK5). CDK5 on rakenteellisesti samanlainen seriini/treoniini-Kinas (2). CDK5: llä ei näytä olevan merkittävää roolia solusyklin säätelyssä (3,4). Se on hyvin tunnettu siitä, että sillä on hallitseva asema keskushermoston kehityksessä, mukaan lukien rooli neuronaalisessa migraatiossa, erilaistumisessa ja adheesiossa (5,6). We ja muut osoittivat myöhemmin, että CDK5: llä on tärkeä rooli syöpäkehityksessä ja etäpesäkkeissä (7-12). Vuonna protila syöpäsoluja, osoitimme, että CDK5 oli kriittinen forcytoskeletal eheys, solujen Muuttoliike ja hyökkäys, ja invivo, etäpesäkkeiden (7). Cdk5 on luontainen KRAS-signalointiin keskeisen tärkeän RAL-signaalin transduktioreitin kautta, mikä tarjoaa potentiaalisen ”huumattavan” kohteen mutanttikras-kasvaimille (8). Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että CDK5: n kieltäminen yksinään tai yhdessä muiden lääkeaineiden kanssa voi tarjota tehokkaan hoitostrategian näille ja muille syöpätyypeille.

tässä tutkimuksessa pyrimme tunnistamaan agentit, jotka olisivat erityisen tehokkaita yhdessä cdk5-kiellon kanssa eturauhassyöpäsoluissa. Siksi esitimme Ascreenin Johns Hopkinsin Huumekirjastosta (JHDL). Jhdl on 3360 farmaseuttisen yhdisteen kokoelma, jolla on onnistunutfully completed safety testing ihmisillä erilaisiin sovelluksiin (13,14). Tätä kirjastoa on käytetty menestyksekkäästi syöpähoidossa käytettävien yhdisteiden uudelleenkäyttöön,mukaan lukien digoksiinin tunnistaminen HIF1a-inhibiittoriksi (15) ja itrakonatsolin tunnistaminen angiogenesisinhibiittoriksi (16). Olemme aiemmin käyttäneet JHDL: ää tunnistaaksemme setrimoniumbromidin ja irinotekaanin yhdistelmät, joilla on lisääntynyt antitumor-aktiivisuus eturauhassoluja vastaan, jotka ilmentävät alhaisia etäpesäkkeiden vaimentajageenin N-mycdownreguloidun geenin 1 (NDRG1) (17) tasoja.Täällä suoritimme samanlaisen jhdl-seulonnan eturauhassoluilla, jotka eroavat CDK5-aktiivisuudesta. Tiloroni todettiin yhdistelmäksi in vitro synteettisen kuolleisuuden inCDK5 – puutteellisten eturauhassyöpäsolujen kanssa.

materiaalit ja menetelmät

soluviljelmä

PC3 eturauhassyövän solulinjat saatiin ATCC: stä. Nämä solut ovat peräisin luun etäpesäkkeestä 62-vuotiaalta eturauhassyöpäpotilaalta. Ihmisen eturauhasen fibroblastit, jotka Tri J. Isaacs laati, saatiin 62-vuotiaan eturauhassyöpäpotilaan eturauhasbiopsiasta, jonka Gleason-pisteet olivat 4. Bothcell-linjat kasvatettiin ja ylläpidettiin Rpmi-1640 (Invitrogen) – medialla, jota täydennettiin 10% sikiön naudan seerumilla. Soluja viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 37°C: ssa 5%: n Co2atmosfäärissä.

PC3: n CDK5dn-solulinjan luominen

CDK5-funktion häviäminen tapahtui PC3-soluissa siirtämällä dominanttinegatiivista konstruktiota, joka sisältää d144nmutaation, ystävällisesti tohtori L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Käytetty protokolla on kuvattu aiemmin (7). Lyhyesti sanottuna konstruktio oli alaluokiteltu kaksisuuntaisessa Tet-vektorissa, pBI-EGFP(Bd Biosciences), johon oli lisätty zeosiiniresistenssigeeni (ystävällisesti toimittanut tohtori K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School of Medicine). PBI-EGFP tyhjä vektori tai PBI-EGFPCDK5dn vektori siirrettiin PC3-soluihin, jotka sisälsivät aTet-Off promoter construct, PTA (BD Biosciences).

Western blotting

Western blotting suoritettiin edellä kuvatulla tavalla (19). Geeliin oli ladattu kymmenen mikrogrammaa proteiinia. Primaariset vasta-aineet liuotettiin puskuriin . Anti – CDK5 (Sigma-Aldrich) laimennettiin 1:1000; anti-vinkuliini (Millipore,Upstate) laimennettiin 1: 4000. Sekundaariset vasta-aineet laimennettiin ATA 1:4 000-laimennoksella. Kaistan intensiteetin normalisointi hoidettiin kodinhoitajaproteiini vinkuliinilla. Kehitetyt blotit suunniteltiin Mikrotek-skannerilla.

haavan paranemismääritys

haavan paranemismääritykset tehtiin confluentPC3-kontrollilla (joka sisälsi tyhjät PBI-EGFP-vektorit) tai PC3: n Cdk5dncell-soluilla. Kumikärkisellä kaavimella raaputettiin kuoria pois. Kevyet mikroskooppikuvat otettiin heti ja 24 hafteria kaavittiin.

Pienimolekyylisen kirjaston seulonta

jhdl-kirjastoa on kuvattu aiemmin(13,14,17).JHDL-yhdisteiden varastointi ja seulonta suoritettiin edellä kuvatulla tavalla (17).Lyhyesti PC3-ohjaus ja CDK5dn-solut kylvettiin 96-kuoppalevyihin (1×103 solua/kuoppa) ja niiden annettiin kiinnittyä yön yli. Täydellisiin RPMI-väliaineisiin lisättiin 5 µl lääkkeitä, jotka oli varastoitu 200 µM: n inDMSO/H2O: n kantaliuoksina, niin että solujen lopullinen pitoisuus oli 10 µM. 48 tunnin käsittelyn jälkeen jokaiseen säiliöön lisättiin 20 µl MTS-reagenssia Celltiter 96™ – Aveousnon-Radioactive Cell Proliferation Assay-menetelmällä 2-4 tunnin ajan 37°C: ssa. Levyt analysoitiin Asoftmax Pro levylukijalla (Molecular Devices). Käsiteltyjen solujen proliferaatiota verrattiin DMSO-käsiteltyjen PC3control-tai CDK5dn-solujen proliferaatioon (proliferaatioindeksi). PC3 CDK5dn-solujen proliferaatioindeksejä verrattiin PC3-kontrollikennojen proliferaatioindekseihin. PubMed-tutkimuksessa arvioitiin mahdollisten osumien kliinistä käyttöä.

MTS-määritykset

MTS-määritykset tehtiin tiloronihoidon antiproliferatiivisen vaikutuksen mittaamiseksi. Tiloronidihydrokloridia (Sigma-Aldrich) varastoitiin 10 mM: n varastolutiivina DMSO: ssa -20°C: n lämpötilassa. Tuhat PC3-kennoa pinnoitettiin in96-kuoppalevyillä, jotka sisälsivät 100 µl täydellistä RPMI-mediaa. Noin 50-prosenttisessa yhtymäkohdassa annettiin tiloronidihydrokloridia. Forexperiments yhdiste laimennettiin täydellisessä RPMI media toobtain haluttu lopullinen pitoisuus. 72 tunnin hoidon jälkeen(tiloronimonoterapia) MTS-reagenssia lisättiin ja imeytyminen at490 nm määritettiin SoftMax Pro-levylukijalla.Proliferaatioindeksit laskettiin; kontrollina käytettiin käsittelemättömiä PC3-kontrollin orcdk5dn-soluja (103 µl: ssa täydellistä RPMI-mediaa). Oppilaiden t-kokeissa arvioitiin p-arvoja.

Klonogeeniset määritykset

Klonogeeniset määritykset tehtiin tiloronihoidon jälkeisen pitkäaikaisen elintason arvioimiseksi. Eturauhassyöpäsolut levitettiin 60 mm: n astioihin ja niiden annettiin tarttua. 50-60%: n konfluenssilla soluja käsiteltiin tiloronilla 72 tunnin ajan. tämän jälkeen kunkin lautasen 1×103 solua pinnoitettiin kolmena kappaleena 60 mm: n astioissa ja inkuboitiin täydellisessä RPMI-mediassa 12 päivän ajan.Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin liuoksella, joka sisälsi 90%metanolia ja 10% kideviolettia (2,3% kideviolettia, 0,1% ammoniumoksalaattia ja 20% etyylialkoholia; Sigma). Pesäkkeet kartoitettiin tietokoneskannerilla (Microtek) ja laskettiin manuaalisesti.Opiskelijoiden t-testeissä arvioitiin, olivatko solulinjojen väliset erot tilastollisesti merkitseviä.

3D-kasvumääritys

3D-kasvumääritys suoritettiin käyttäen samaa protokolia kuin aiemmin (17). Lyhyesti sanottuna, spheroideja syntyi tuottamalla PC3-soluja 16 tunnin ajan roikkuvana pisarana kostutetun levyn päällä CO2-inkubaattorissa täydellisessä RPMI-mediakomponentissa, joka sisältää 0,5% metyyliselluloosaa. Spheroidit upotettiin inkollageenimatriisiin (Bd Biosciences), käsiteltiin tiloronilla ja kuvattiin Nikon Eclipse Ti-mikroskoopilla (Nikon) hoitopäivänä ja kuusi päivää hoidon aloittamisen jälkeen. Spheroid-ja kokonaispinta-alat (spheroidplus-idut) mitattiin ImageJ: llä. Taita lisäykset laskettiin jakamalla spheroid/kokonaispinta-ala päivänä 6 spheroid / kokonaispinta-ala päivänä 0 kunkin yksittäisen spheroid. Kullekin linjalle ja aikapisteelle kertaistettiin neljän spheroidin lisäykset. Tilastolliset analyysit tehtiin Opiskelijatesteillä.

tulokset

Cdk5: n aktiivisuuden suppressio

PC3: n eturauhassyöpäsolut valittiin jhdlcompound-seulaan niiden erittäin metastaattisen potentiaalin ja androgeenien riippumattomuuden vuoksi, mikä muistutti aggressiivista metastaattikastraattiresistenttiä eturauhassyöpää. CDK5: n aktiivisuus estyi dominanttinegatiivisen mutaation (CDK5144N) transfektiolla ja valinnalla. Näiden PC3 CDK5dn-solujen kokonaisproteiinipitoisuus oli suurempi kuin PC3-kontrollisolujen (tyhjällä vektorilla transfektoidut PC3-solut) (Kuva. 1 A). Awound healing assay (8) vahvisti, että CDK5 oli toiminnallisesti inaktiivinen näissä soluissa; toisin kuin PC3control-solut, PC3 CDK5dn-solut eivät kyenneet tunkeutumaan kaavitun pinta-alan sisään (Kuva.1b).

Kirjastonäyttö cdk5-aktiivisuuteen perustuville PC3-soluille suunnatuille yhdisteille

suoritettiin suurikapasiteettinen seulontakoe, jossa valittiin cdk5-aktiivisuuteen perustuvia PC3-soluihin kohdistuvia yhdisteitä. PC3control-ja CDK5dn-soluja käsiteltiin kaikilla jhdl-yhdisteillä 10 µM: n lämpötilassa 48 tunnin ajan. Tunnistaaksemme osumia, jotka valikoivasti kohdistuvat PC3-soluihin CDK5-ilmaisun perusteella, valitsimme kaikki yhdisteet, joissa proliferaatioindeksisuhde (CDK5dn / control) oli alle 0,5 tai yli 1,5 (Kuva. 2 A).Lisäksi osumien oli estettävä PC3-solujen solujen lisääntymistä vähintään 10%: lla, koska olimme erityisen kiinnostuneita yhdisteistä, jotka estivät solujen kasvua (vaaka-ja pystyviiva kaaviossa). Wealso valitsi kaikki yhdisteet, jotka estivät solujen proliferaatiota inPC3-soluja 70%: lla (kuvaajan vasemmassa alakulmassa), koska olimme kiinnostuneita tunnistamaan potentiaalisia erittäin tehokkaita kasvainten vastaisia aineita. Jatkokarsintaan valittiin yhteensä 41 osumaa.

suoritettiin toisioseula, jossa ensisijaiselta näytöltä valittuja näyttöjä lisättiin 10 µM: n tarkkuudella 48 tunnin ajan PC3control-ja CDK5dn-soluihin kolmena kappaleena väärien positiivisten tulosten kitkemiseksi (Kuva. 2b). Cutoff-arvot olivat hieman lievempiä kuin ensisijaisessa näytössä; komppeja pidettiin osumana, kun proliferaatioindeksien(CDK5dn/control) suhde oli alle 0,7 tai yli 1,4. Tämä johti kolmen yhdisteen tunnistamiseen, jotka kohdistuvat valikoivasti CDK5: tä ilmentäviin PC3-soluihin: rutilantin, etakridiinilaktaatti ja setalkoniumkloridi (Kuva. 2C).Näitä yhdisteitä ei ole käytetty kasvainten vastaisina aineina, ja niidenpotentiaalinen kliininen käyttö suonensisäisinä kasvainten vastaisina aineina näyttää rajalliselta (20-23). Toinen yhdiste, tiloroni analogR9536-DA, oli erittäin tehokas estämään molempia isogeenisiä PC3-solulinjoja (>70% inhibitio), mutta se esti pc3cdk5dn-solujen proliferaatiota hieman tehokkaammin (suhde CDK5dn/kontrolli:0, 687). Tiloronilla ja sen analogeilla on antiviraalinen vaikutus, joka vaikuttaa ainakin osittain interferonia indusoivina lääkeaineina (24-26), ja niillä on osoitettu prekliinisesti ja kliinisesti myös antitumoraktiivisuutta (27, 28).

Tiloroni kohdistuu selektiivisesti PC3-soluihin, joiden cdk5-aktiivisuus on alhainen

jatkoimme kokeita juuri liuotetulla tiloronidihydrokloridilla. 72 tunnin tiloronikäsittelyn jälkeen eri pitoisuuksina sen IC50–arvo oli 8-12µm PC3 CDK5dn-soluissa ja 15 µM PC3-kontrollisoluissa MTS-määrityksissä(Kuva. 3 A). 8 µM: n kohdalla proliferaatioaktiivisuus väheni 24% PC3-kontrolleissa ja 47% Cdk5dncelleissä (p=0, 001). Tiloronin innormaalisten eturauhassolujen toksisuuden arvioimiseksi MTS-määrityksiä tehtiin ihmisen eturauhasen fibroblastien tiloronetreataatiolla (Kuva. 3b). Näiden solujen herkkyys totiloronille oli samanlainen kuin PC3-kontrollisoluilla.

tiloronin inhibitorista vaikutusta PC3-soluissa arvioitiin edelleen klonogeenisilla määrityksillä(Kuva. 3C). PC3 CDK5dn-solut olivat myös huomattavasti PC3-kontrollisoluja herkempiä tiloronille tässä määrityksessä. 10 µM: n tiloronikäsittely johti 40%: n klonogeenisurvivalenttiin PC3 CDK5dn-soluissa ja 72%: iin PC3-kontrollisoluissa(p=0, 002).

spheroidikasvutesti tehtiin 3DTUMORIN kasvun ja PC3-solujen invaasion arvioimiseksi tiloronihoidon yhteydessä (Kuva. 4). Sekä PC3-ohjaus-että PC3CDK5dn-kennoilla oli vastaava spheroidin koon kasvu kuuden päivän aikana. Kokonaiskoko (spheroidien ja itujen koko) oli kuitenkin suurempi PC3-kontrollisoluissa, mikä vahvisti, että vasta hoidetuilla PC3 CDK5dn-soluilla oli pienempi invasiivinen potentiaali verrattuna PC3-kontrollisoluihin. Kun tiloronia annettiin 5µm: ssa, PC3-kontrollisferoideilla oli samanlainen kasvu ja invasiivinen malli kuin käsittelemättömillä PC3-kontrollisoluilla (p=0, 59) (Kuva. 4B, vasen kaavio). Kuitenkin, kun PC3: n Cdk5dn-soluihin annettiin sama pitoisuus, havaittiin sekä palleroidikoon että kokonaiskoon merkittävää pienenemistä (p<0, 01), mikä viittaa siihen, että tiloroni onnistui estämään palleroidikasvun ja PC3: n CDK5dn-solujen invaasion, kun sitä annettiin 5 µM (Kuva. 4B, oikea kaavio). 10 µM: n kohdalla molempien isogeenisten solulinjojen vaikutus oli heikentynyt.

Keskustelu

JHDL, hyvin luonnehdittujen lääkeyhdisteiden kirjasto, kehitettiin helpottamaan huumeidenrepurposing-tutkimuksia (29). Kirjastossa olevien yhdistelmien laaja in vivo-toksisuus ja farmakokineettiset profiilit mahdollistavat näiden yhdisteiden nopean myöhemmän kehittymisen. Useita jhdl: n yhdisteitä on kehitetty kliinisiin syöpätutkimuksiin ja muihin terapeuttisiin sovelluksiin(13,14,16,17,30–32).

tässä tutkimuksessa seuloimme jhdl: nkomponenteista, jotka eri tavoin estävät syöpäsolujen kasvua CDK5: n eston esiintymisessä.; tiloroni ja tiloroni-analogi tunnistettiin aineiksi, jotka valikoivasti kohdistuvat CDK5: n puutteellisiin PC3-Prostaattisiin syöpäsoluihin. Tiloronia (Amixin IC) käytetään kliinisestimaissa oraalisesti aktiivisena antiviraalisena aineena (25). Tiloronia on testattu ihmisilläaivojen glioomien, kurkunpään papillomatoosin ja breast-syövän (28, 33, 34) hoidossa.Vaikka antitumor tehoa raportoitiin, kiinnostus tiloronia kohtaan syöpähoidossa on laantunut. Äskettäin Zhou et al raportoivatuusia tiloronianalogeja, joilla on parantunut syöpäaktiivisuus (35). Nämä analogit voivat olla lupaavia tutkimaan, erityisesti yhdessä CDK5: n eston kanssa.

sen lisäksi, että TILORONI saattaa heikentyä yhdessä CDK5: n eston kanssa, tiloronin tunnistaminen lääkkeeksi, joka kohdistuu selektiivisesti soluihin inaktiivisen CDK5: n kanssa, viittaa mahdollisiin lääkeaineluokkiin, jotka voimistavat CDK5: n eston tehokkuutta. Tiloronia on luonnehdittu aninterferoni-induktoriksi (24). Tämä osoittaa, että itse interferoni tai jokin muu interferonindukeeri, kuten TLR-agonisti, voivat olla hyödyllisiä yhdessä aCDK5-estäjän kanssa. Asiaan voi kuitenkin liittyä muitakin mekanismeja. Esimerkiksi tiloroni on myös DNA: n interkalatoiva aine (24), ja voidaan kuvitella, että se voi moduloida kromatiinin rakennetta ja geeniekspressiota. Tiloronin muut toiminnot, mukaan lukien signalointireitti ja transkriptio factorinteraktiot (36,37), voivat myös olla mukana. Tarvitaan lisätutkimuksia sen tarkan vaikutusmekanismin selvittämiseksi, jolla oroni kohdistuu valikoivasti CDK5-negatiivisiin eturauhassoluihin.

kiitokset

kirjoittajat haluavat kiittää professoria P. J. Van Diestand E. Van der Wall niiden tukea ja keskustelua ja ProfessorsM.A. Carducci ja J. T. Isaacs laboratoriomateriaalien toimittamisesta. Tätä tutkimusta tuki Lentoemäntä MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 ja NCI SPORE grant P50 CA58236. M. D. W.: tä tuki tohtori Saal van Zwanenbergstichting ja HuygensScholarship-ohjelma.